李慧敏，楊 琳（陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院產(chǎn)科，陜西咸陽 712000）

稽留流產(chǎn)是一種特殊的流產(chǎn)類型，也叫胎停育，指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)尚未自然排出者。稽留流產(chǎn)比例呈逐年上升趨勢(shì)，在早期正常妊娠中高達(dá)15%～20%，其與多種因素相關(guān)，如生活環(huán)境、感染、免疫及內(nèi)分泌、染色體異常等，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未明確[1]。死亡的胚胎及病變的胎盤組織滯留于宮腔中釋放凝血活酶，易引發(fā)凝血功能紊亂，嚴(yán)重威脅了女性的健康[2]。因此，明確稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制，有助于該病的早期預(yù)防和治療。蛋白亮氨酸拉鏈基序1（leucine zipper motif 1, APPL1）是絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中的差異蛋白之一，APPL1蛋白可能是誘導(dǎo)稽留流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[3]。研究表明，稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理與APPL1蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激有關(guān)[3]。核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種對(duì)氧化還原敏感且廣泛表達(dá)的蛋白，能夠調(diào)節(jié)參與抗氧化作用。核因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2/ARE）是最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，也是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的主要承擔(dān)者，當(dāng)機(jī)體遭受有害刺激時(shí)，其可抵抗外界氧化刺激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受損傷[4]。研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到活性氧（reactive oxygen species, ROS）等的刺激時(shí)，Nrf2可與其抑制劑Keap1結(jié)合活化，轉(zhuǎn)運(yùn)入核與ARE結(jié)合，激活靶基因調(diào)控抗氧化酶、II相代謝酶，如血紅素加氧酶1（haem oxygenase 1 ，HO-1），醌氧化還原酶1及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）等，發(fā)揮抗氧化損傷作用[5]。研究表明，HO-1具有與ARE相似的抗氧化元件，可通過Nrf2調(diào)控ARE形成Nrf2/HO-1通路[6]。因此本研究探究分析了稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1表達(dá)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，探討了其在稽留流產(chǎn)發(fā)生中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年6月～2021年6月在陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院診斷為稽留流產(chǎn)并行人流術(shù)的46例患者進(jìn)行研究，另選取同期要求行人工流產(chǎn)術(shù)的50例正常早孕婦女作為對(duì)照組，兩組年齡23～36歲，月經(jīng)規(guī)律，停經(jīng)6～11周。實(shí)驗(yàn)組平均年齡31.5±2.9歲，平均身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）23.4±3.1kg/m2，平均胎齡6.7±0.9周，平均孕次2.4±0.6次，平均流產(chǎn)次數(shù)2.0±0.4次；對(duì)照組平均年齡30.7±2.8歲，平均BMI 23.9±3.2 kg/m2，平均胎齡6.8±0.9周，平均孕次2.3±0.5次，平均流產(chǎn)次數(shù)2.1±0.3次。兩組患者年齡、BMI，胎齡、孕次、流產(chǎn)次數(shù)等基線資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究，患者及家屬均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)驗(yàn)組：B超檢查示宮內(nèi)妊娠囊＞2cm，未見胎心管搏動(dòng)，未見胚芽或胚芽長(zhǎng)度＞1cm；有停經(jīng)史；清宮術(shù)前宮口未開。②對(duì)照組：超聲證實(shí)胚胎發(fā)育正常，有心管搏動(dòng)；既往無死胎、自然流產(chǎn)及死產(chǎn)史；無腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮肌瘤、宮腔黏連、子宮畸形、子宮腺肌癥等；②母體伴有嚴(yán)重貧血、感染并發(fā)慢性肝腎疾病、心血管疾病、多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能減退癥及糖尿病等；③孕期有藥物、毒物、射線接觸史等；④有家族遺產(chǎn)病史。

1.2 試劑與儀器 SP免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋有限公司）；兔抗人APPL1單抗，Nrf2單抗，HO-1單抗（英國(guó)Abcam公司）；ROS，SOD，丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司）；電泳儀、凝膠圖像分析儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；RIPA蛋白裂解液、PVDF膜（美國(guó) Sigma-Aldric公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher 科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：采用負(fù)壓吸引術(shù)吸出孕囊后，用無菌生理鹽水洗掉黏液和血液，剔除蛻膜組織，醫(yī)用濾紙吸去水分，分離出絨毛組織沖洗干凈，分為3份，2份置于高壓滅菌凍存管，迅速放入液氮管中-80℃超低溫保存；另1份用10g/dl中性福爾馬林溶液固定24h，脫水、包埋，制為樣本蠟塊。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1表達(dá)：取蠟塊組織樣本4 μm厚度切片，脫蠟、脫水，抗原高壓修復(fù)；3g/dl過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，滴加APPL1，Nrf2和HO-1一抗覆蓋組織，4℃冰箱孵育過夜；第2天滴加二抗，室溫孵育20min，DAB試劑盒避光顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，鏡下觀察拍照。

1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：APPL1，Nrf2和HO-1陽性染色呈黃色、棕黃色或棕褐色，陰性對(duì)照無著色。隨機(jī)選取高倍鏡下6個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分，著色強(qiáng)度：以無著色(-)、黃色 (+)、棕黃色(++)和棕褐色(+++)分別計(jì)為0～3分；陽性細(xì)胞百分比；以≤5%，6%～25%，26%～50%，51%～75%和＞75%分別計(jì)為0～4分。免疫組織化學(xué)總得分為兩項(xiàng)計(jì)分的乘積，＜4分定義為陰性，≥4分定義為陽性。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)：取絨毛組織100 mg，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，室溫封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)蛋白一抗，4 ℃過夜；次日室溫下加入二抗孵育1 h，洗膜3次，ECL發(fā)光顯色。采用ImageJ 軟件定量分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行顯影拍照，蛋白定量表達(dá)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：從-80℃超低溫冰箱取絨毛組織約100mg，加入RIPA蛋白裂解液1 ml，充分勻漿后4℃，12 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至EP管，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定ROS，SOD和MDA含量，操作如下：按ELISA檢測(cè)說明書設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，每組設(shè)3個(gè)平行孔，除空白孔外在酶標(biāo)板各孔加入制備的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體100 μl，封膜板覆蓋酶標(biāo)板，37℃孵育1h，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，于各孔加入顯色底物，避光孵育15 min，后加入終止液100 μl/孔，混勻后上機(jī)，在酶標(biāo)儀450nm 處測(cè)定各孔吸光度值，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中ROS，SOD和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；Pearson分析APPL1，Nrf2和HO-1表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨 毛 組 織 中APPL1，Nrf2和HO-1蛋 白 的定位表達(dá) 免疫組化法檢測(cè)顯示，絨毛組織中APPL1，HO-1陽性表達(dá)定位主要分布于細(xì)胞胞漿，Nrf2陽性表達(dá)定位主要分布于細(xì)胞胞漿或胞核，呈黃色、棕黃色或棕褐色，見圖1。實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)陽性率均低于對(duì)照組，免疫組化染色評(píng)分亦低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 絨毛組織中APPL1蛋白免疫組化圖（×200）

表1 兩組絨毛組織中APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表達(dá)比較

2.2 兩組APPL1，Nrf2和HO-1蛋白定量表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平分析 見表2和圖4。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APPL1，Nrf2和HO-1蛋白在實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS，MDA水平較對(duì)照組明顯升高，SOD水平則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜0.05）。

圖2 絨毛組織中Nrf2蛋白免疫組化圖（×400）

圖3 絨毛組織中HO-1蛋白免疫組化圖（×400）

圖4 Western blot電泳蛋白表達(dá)圖譜條帶圖

表2 兩組APPL1，Nrf2，HO-1蛋白定量表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

表2 兩組APPL1，Nrf2，HO-1蛋白定量表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

?

2.3 稽留流產(chǎn)絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性 見表3?；袅鳟a(chǎn)絨毛組織中APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表達(dá)與ROS，MDA水平均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與SOD水平均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

表3 APPL1，Nrf2，HO-1蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

稽留流產(chǎn)的處理較為困難，由于胎盤組織機(jī)化，與子宮壁緊密條件下黏連，導(dǎo)致刮宮困難。一般月份稍大的流產(chǎn)物留滯宮腔時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體凝血功能障礙，引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，而清宮會(huì)使子宮內(nèi)膜損傷誘發(fā)宮腔黏連，甚至不孕，嚴(yán)重影響患者身心健康[7]。研究表明，稽留流產(chǎn)的發(fā)生與機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)[3]。APPL1是一種介導(dǎo)脂聯(lián)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)蛋白，研究表明，APPL1通過調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路參與各種生物學(xué)行為，如細(xì)胞黏附、代謝、遷移、凋亡和增殖等[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素通過激活A(yù)dipoR1/APPL1/LKB1/AMPK信號(hào)通路的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)來清除ROS，降低由于缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[10]。研究表明，APPL1過表達(dá)可促進(jìn)瘦素誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中STAT3，ERK1/2和Akt磷酸化，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和遷移，反之可抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，揭示了瘦素促進(jìn)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)的新機(jī)制[11]。APPL1參與組成的脂聯(lián)素可增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，通過AdipoR1/APPL1信號(hào)傳導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡水平和ROS水平。Nrf2在正常狀態(tài)下存在于細(xì)胞質(zhì)中，與KEAP1相結(jié)合后降解，當(dāng)機(jī)體存在氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf和KEAP1無法被蛋白酶體降解，積累在細(xì)胞質(zhì)中并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，激活HO-1在內(nèi)的下游抗氧化基因。研究證實(shí)APPL1-AdipoR1復(fù)合物脂聯(lián)素可促進(jìn)Nrf2核易位，激活Nrf2相關(guān)抗氧化信號(hào)通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。

在正常妊娠11周之前，胚胎和胚盤生長(zhǎng)于低氧（氧濃度2%～5%）環(huán)境中。為維持低氧環(huán)境，降低有氧代謝產(chǎn)生的ROS，大量抗氧化劑及抗氧化信號(hào)通路被激活，平衡氧化還原狀態(tài)，以維持正常妊娠[13]。孕早期處于低氧狀態(tài)的絨毛間隙可使胎兒免受ROS的侵害，而過量ROS具有細(xì)胞毒性，逸入細(xì)胞內(nèi)可造成滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜、染色液、蛋白及DNA損傷，或者對(duì)細(xì)胞基質(zhì)膠原蛋白造成損傷，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能下降或部分細(xì)胞死亡，母體血提前流入容貌間隙，對(duì)母胎界面造成不可逆的損傷，胎兒受ROS侵害而死亡[14]?；袅鳟a(chǎn)患者的絨毛組織中ROS，MDA水平顯著升高，使胚胎細(xì)胞處于高氧狀態(tài)，從而抑制了SOD生成，介導(dǎo)胚胎停育。既往研究表明，當(dāng)ROS異常升高或快速波動(dòng)時(shí)會(huì)干擾滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能，從而導(dǎo)致多種類型的早期流產(chǎn)，如反復(fù)性流產(chǎn)、自發(fā)性流產(chǎn)和葡萄胎等[15-16]。SOD是一種重要的抗氧化金屬酶，發(fā)揮抗氧化劑的作用，可將氧離子轉(zhuǎn)化為H2O2和氧分子。稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中ROS水平升高，SOD活性降低，氧化應(yīng)激是稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理之一[17]。當(dāng)絨毛組織中ROS的大量產(chǎn)生會(huì)造成組織中的滋養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)成分被氧化所形成的MDA能夠反映氧化損傷的程度[15]。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，存在于氧代謝細(xì)胞中，可有效清除自由基，降低MDA對(duì)細(xì)胞及組織的破壞作用。細(xì)胞內(nèi)存在一些復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，目的是對(duì)抗ROS積累和氧化應(yīng)激損傷，其中Nrf2被認(rèn)為是一種對(duì)氧化還原敏感且在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)的蛋白，調(diào)節(jié)并參與抗氧化機(jī)制，誘導(dǎo)一系列抗氧化蛋白基因轉(zhuǎn)錄；HO-1是受Nrf2調(diào)節(jié)的最重要的基因之一，在細(xì)胞中發(fā)揮重要的抗炎、抗氧化調(diào)節(jié)作用。HO-1可通過膽綠素還原酶將血紅素降解為膽綠素、CO和Fe2+，膽綠素及其還原型膽紅素具有直接清除ROS的能力，構(gòu)成內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化、凋亡等多種生物學(xué)細(xì)胞活動(dòng)[18]。

基于既往研究報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1蛋白陽性率及表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，提示三者的異常表達(dá)可能與稽留流產(chǎn)有關(guān)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路在稽留流產(chǎn)者中受到抑制，與XIE等[19]報(bào)道一致。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中ROS，MDA水平均高于對(duì)照組，SOD水平低于對(duì)照組，提示機(jī)體氧化/抗氧化物質(zhì)失衡參與了稽留流產(chǎn)的發(fā)生及病情進(jìn)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中APPL1，Nrf2和HO-1表達(dá)與ROS，MDA水平均呈負(fù)相關(guān)，與SOD水平呈正相關(guān)，提示APPL1，Nrf2和HO-1蛋白的異常表達(dá)與氧化應(yīng)激的發(fā)生相關(guān)。本研究從氧化應(yīng)激失衡角度探究表明，APPL1，Nrf2和HO-1的異常表達(dá)可能通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而誘導(dǎo)了稽留流產(chǎn)的發(fā)生，為稽留流產(chǎn)的發(fā)病、診治提供了思路。然而本研究結(jié)果較為表淺、局限，APPL1調(diào)控Nrf2/HO-1通路參與氧化應(yīng)激介導(dǎo)稽留流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制還有待通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究驗(yàn)證。

綜上所述，APPL1，Nrf2，HO-1在稽留流產(chǎn)絨毛組織中低表達(dá)，且與氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS，MDA和SOD水平具有顯著相關(guān)性，其三者異常表達(dá)可能通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激失衡進(jìn)而誘導(dǎo)了稽留流產(chǎn)的發(fā)生。