劉 周，杭修兵，儲(chǔ)雯雯，李 昕，姚 杰，周 強(qiáng)（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230601）

大腸埃希菌（Escherichia coli）是臨床常見的條件致病菌，可導(dǎo)致各類醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染，常見的感染類型包括泌尿系統(tǒng)感染、腹腔感染、血流感染等[1-2]。大腸埃希菌易通過攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及頭孢菌素酶編碼基因?qū)︻^孢類抗生素產(chǎn)生耐藥表型，而碳青霉烯類抗生素是治療上述細(xì)菌所致重癥感染的主要抗生素[1]。近年來，雖然大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗生素仍然保存較低的耐藥率，但由于其整體基數(shù)較大，因此耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistanceE. coli,CREC）在臨床中仍然較為多見[3-4]。CREC常呈現(xiàn)多重耐藥表型，僅對(duì)多黏菌素、替加環(huán)素等敏感。2015年，我國(guó)學(xué)者首次在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥（mobile colistin resistance，mcr）基因[5]，其后mcr系列基因在臨床菌株中不斷被檢出[6]。目前本地區(qū)CREC菌株的mcr基因攜帶情況報(bào)道較少，因此本研究擬對(duì)本地區(qū)一所省級(jí)綜合性三甲醫(yī)院臨床分離的CREC臨床分布、碳青霉烯耐藥基因及mcr基因進(jìn)行檢測(cè)，為臨床多重耐藥菌防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2020年7月～2021年6月期間臨床住院患者送檢各類臨床標(biāo)本分離的非重復(fù)CREC菌株共計(jì)33株，同時(shí)收集相應(yīng)患者性別、年齡及住院科室等基本臨床資料。CREC的判定標(biāo)準(zhǔn)為菌種鑒定為大腸埃希菌且亞胺培南最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）值≥4μg/ml和/或厄他培南的MIC≥2μg/ml[7]。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株及PCR陰性對(duì)照菌株均為大腸埃希菌ATCC25922。部分PCR陽性對(duì)照菌株為本實(shí)驗(yàn)前期測(cè)序確證并保存的臨床菌株。

1.2 儀器與試劑 Microflex-LT型質(zhì)譜分析儀（德國(guó)BRUKER公司），VITEK-2型細(xì)菌藥敏檢測(cè)儀（法國(guó)BioMérieux公司），CHEF Mapper XA型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Biometra型PCR儀（德國(guó)Analytikjena公司），Tanon1600型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。Agarose D-5瓊脂糖凝膠、Xba I內(nèi)切酶（Takara公司），藥敏紙片（英國(guó)Oxoid公司），多黏菌素B藥物標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉公司），多黏菌素B藥敏檢測(cè)（MIC法）試劑（溫州康泰公司），所有PCR引物由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌鑒定、藥敏檢測(cè)及碳青霉烯酶表型分析：應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(ma

trix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)進(jìn) 行 菌 種 鑒定；應(yīng)用VITEK-2藥敏分析儀及配套藥敏卡進(jìn)行藥敏檢測(cè)，折點(diǎn)參照CLSI 2020版標(biāo)準(zhǔn)[7]；應(yīng)用微量肉湯稀釋法進(jìn)行多黏菌素B的藥敏檢測(cè)，折點(diǎn)參照EUCAST 2020版標(biāo)準(zhǔn)[8]；聯(lián)合碳青霉烯滅活（modified carbapenem inactivation method, mCIM）及EDTA碳青霉烯滅活（EDTA- carbapenem inactivation method, eCIM）試驗(yàn)分析CREC菌株碳青霉烯酶表型[7]。

1.3.2 碳青霉烯耐藥基因及mcr系列基因檢測(cè)：提取待測(cè)菌株DNA模板，應(yīng)用PCR篩檢待測(cè)菌株常見碳青霉烯酶基因（blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA-48）及mcr系列基因（mcr-1～mcr-9），引物序列見表1及擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)[9-11]。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序后應(yīng)用GenBank NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析。

表1 耐藥基因PCR檢測(cè)引物

1.3.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）分析：取沙門菌H9812及mcr-9陽性CREC菌株單個(gè)菌落接種于LB肉湯，37℃振蕩增菌6h后富集菌體，用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠制作包埋膠塊并置于蛋白酶K溶液中50℃水浴18h。膠塊多次清洗后，置于Xba I內(nèi)切酶體系37℃水浴4h。電泳條件參考文獻(xiàn)[12]。電泳膠塊染色成像后用Bio-Numerics軟件分析，PFGE條帶差異大于7條為不同pulsotype型[13]。

1.3.4 多黏菌素誘導(dǎo)分析：參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道進(jìn)行，待測(cè)mcr-9陽性CREC菌株用M-H肉湯制備麥?zhǔn)蠞舛葹?.0的菌懸液，分別加入多黏菌素B使得體系中藥物濃度為1/2倍MIC值。37℃振蕩培養(yǎng)6h后富集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次后用無菌生理鹽水配置麥?zhǔn)蠞舛葹?.5的菌懸液，用于微量肉湯稀釋法檢測(cè)待測(cè)菌對(duì)多黏菌素的MIC值。上述試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（患者年齡）以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示?；九R床資料及藥敏檢測(cè)結(jié)果錄入WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株臨床分布 33株CREC分離自尿液標(biāo)本（10株，30.3%）、痰液標(biāo)本（8株，24.2%）、膿液及分泌物標(biāo)本（6株，18.2%）、血液標(biāo)本（5株，15.2%）、腹腔積液標(biāo)本（2株，6.1%）、膽汁標(biāo)本（1株，3.0%）、導(dǎo) 管 尖 端（1株，3.0%）。CREC感染臨床患者以男性為主（63.6%），患者年齡25～87（62.4±15.0）歲?；颊咚谂R床科室主要為泌尿外科（5例，15.2%）、重癥監(jiān)護(hù)病房（4例，12.1%）、血液內(nèi)科（4例，12.1%）、普外科（3例，9.1%）、急診外科（3例，9.1%）等。

2.2 體外藥敏結(jié)果 見表2。CREC菌株對(duì)頭孢菌素類及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗生素耐藥率均為100.0%，對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率為93.9%～100.0%，對(duì)左氧氟沙星的耐藥率為84.8%，對(duì)阿米卡星、替加環(huán)素及多黏菌素B的耐藥率分別為24.1%，3.4%及0.0%。

表2 CREC菌株對(duì)抗生素的體外藥敏結(jié)果

2.3 碳青霉烯酶表型及基因型檢測(cè) 聯(lián)合mCIM和eCIM試驗(yàn)檢測(cè)顯示，31株CREC（93.9%）產(chǎn)碳青霉烯酶，改良碳青霉烯類失活法（ mCIM）試驗(yàn)陽性菌株8株，EDTA-碳青霉烯類失活法（eCIM）試驗(yàn)陽性菌株23株。PCR及測(cè)序結(jié)果檢測(cè)顯示，mCIM陽 性CREC均 攜 帶blaKPC-2基 因（8株，24.2%）；eCIM陽性CREC均攜帶blaNDM基因（23株，69.7%），其中blaNDM-5陽性12株、blaNDM-1陽性10株、blaNDM-3陽性1株。部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1A，B。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖（A. blaKPC基因；B. blaNDM基因；C. mcr-9基因）

2.4 mcr基因檢測(cè)及多黏菌素B誘導(dǎo)耐藥特征 PCR檢測(cè)顯示，所有菌株的mcr-1～mcr-8基因均為陰性，有3株（9.1%）CREC菌株（試驗(yàn)編號(hào)：CR_EC12，CR_EC16，CR_EC26）攜 帶mcr-9基 因，見圖1C；且3株CREC菌株均攜帶blaNDM基因，見表3。PFGE結(jié)果顯示三者間條帶差異大于7條，提示為不同pulsotype型，菌株間無同源性，見圖2。

表3 多黏菌素B誘導(dǎo)耐藥結(jié)果

圖2 三株mcr-9陽性CREC菌株的PFGE聚類分析圖

經(jīng)多黏菌素B（1/2倍MIC濃度）預(yù)處理6h后，3株mcr-9陽性CREC對(duì)多黏菌素B的MIC值出現(xiàn)不同程度的升高，CR_EC12號(hào)菌株原始MIC值為1μg/ml，誘導(dǎo)后MIC值為16～32μg/ml；CR_EC16號(hào)菌株原始MIC值為1μg/ml，誘導(dǎo)后MIC值為4～8μg/ml；CR_EC26號(hào)菌株原始MIC值為0.5μg/ml，誘導(dǎo)后MIC值為1～2μg/ml。

3 討論

碳青霉烯酶是一類能夠水解亞胺培南或美羅培南的β-內(nèi)酰胺酶，根據(jù)Ambler分子分類可分為A，B，D三類。新德里金屬酶（new delhi metallo β-lactamase，NDM）屬于B類金屬β-內(nèi)酰胺酶，可介導(dǎo)菌株產(chǎn)生碳青霉烯耐藥表型[4]。一項(xiàng)全國(guó)性的分子流行病學(xué)研究表明，我國(guó)臨床分離的CREC菌株主要產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶[15]。本研究中，69.7%的CREC菌株攜blaNDM基因，與上述報(bào)道基本一致。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示，blaNDM基因亞型以blaNDM-5為主，其次為blaNDM-1。研究表明，NDM-5與NDM-1相比存在兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)（Val88Leu及Met154Leu）的差異，使得其對(duì)碳青霉烯類抗生素具有更強(qiáng)的水解作用[16]。在我國(guó)blaNDM-5基因多由IncX3質(zhì)粒攜帶，不僅在臨床菌株中被檢出，在社區(qū)環(huán)境及動(dòng)物來源菌株中也陸續(xù)被報(bào)道，提示其存在廣泛的播撒，同時(shí)該類型質(zhì)粒常攜帶多種耐藥基因，可介導(dǎo)菌株獲得多重耐藥表型[16]。本研究中，CREC菌株對(duì)臨床常用的抗生素耐藥率高，主要分離自尿液、痰液及血液標(biāo)本，臨床醫(yī)師在抗感染治療時(shí)應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果并結(jié)合感染部位合理使用抗生素。

多黏菌素是由多黏類芽孢桿菌產(chǎn)生的一種多肽類抗生素，有A，B，C，D和E五種，目前有多黏菌素B和多黏菌素E在臨床上使用。盡管存在腎毒性和神經(jīng)毒性，但是在目前臨床多重耐藥菌檢出率日益攀升的現(xiàn)狀下，多黏菌素類藥物已經(jīng)成為抗感染治療的最后一道防線[5]。因此，當(dāng)質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素B耐藥基因mcr被發(fā)現(xiàn)后，立即引起了全球的廣泛關(guān)注。近年來，mcr基因的變異體（mcr-1～mcr-9）在世界各地被不斷報(bào)道，分布最廣泛的是mcr-1和mcr-9基因[6]。與其它mcr基因不同，攜帶mcr-9基因的菌株多表現(xiàn)為多黏菌素B敏感的體外藥敏表型，但當(dāng)菌株預(yù)先暴露于多黏菌素B藥物環(huán)境中，mcr-9基因的表達(dá)量就會(huì)升高，進(jìn)而產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥表型[14,17]。本研究中的3株mcr-9陽性CREC菌株經(jīng)過1/2倍MIC濃度的藥物預(yù)處理后，其對(duì)多黏菌素B的MIC值均出現(xiàn)了上升，進(jìn)一步證實(shí)了mcr-9陽性菌株的多黏菌素誘導(dǎo)耐藥特征。

另一方面，雖然本研究中的3株mcr-9陽性CREC均同時(shí)攜帶blaNDM，但PFGE分析顯示菌株間無同源性，提示本研究中mcr-9基因不是由菌株克隆播撒導(dǎo)致的傳播。相關(guān)研究表明，mcr-9基因主要由IncHI2型質(zhì)粒攜帶，這種質(zhì)粒往往攜帶大量促進(jìn)其自身水平轉(zhuǎn)移的基因元件，進(jìn)一步加速了mcr-9基因在臨床菌株中的隱匿性播撒[18-19]。因此，本研究中的3例mcr-9陽性菌株也可能與這種質(zhì)粒的水平傳播相關(guān)。目前，頭孢他啶/阿維巴坦、替加環(huán)素和多黏菌素是臨床治療碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌感染的選擇，由于阿維巴坦不能抑制NDM型碳青霉烯酶，因此在治療blaNDM陽性細(xì)菌所致重癥感染時(shí)，多黏菌素B往往成為臨床首選的抗生素[20]。如果mcr-9基因在臨床菌株中廣泛播撒，而常規(guī)的體外藥敏試驗(yàn)又不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)其耐藥表型，則會(huì)給臨床抗感染治療帶來較大風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究分析了本地區(qū)臨床分離CREC菌株的耐藥性及碳青霉烯酶攜帶特征，并初步檢測(cè)了mcr系列基因的攜帶情況。值得注意的是，雖然所有菌株對(duì)多黏菌素B的MIC值均≤2μg/ml，但仍然有9.1%的CREC菌株攜帶mcr-9基因，并且mcr-9陽性菌株均表現(xiàn)為多黏菌素的誘導(dǎo)耐藥特征，這一特殊的耐藥表型需要臨床和微生物實(shí)驗(yàn)室高度重視。由于本研究納入的菌株數(shù)量較少，且為單中心來源，因此研究結(jié)果存在一定局限性，后續(xù)將繼續(xù)增加研究菌株的數(shù)量及來源，同時(shí)對(duì)mcr-9陽性菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，深入菌株的分子型別及攜帶mcr-9質(zhì)粒的分子特征，為臨床多重耐藥菌的防控提供參考數(shù)據(jù)。