汪佳婕，潘永圣 ，安 婧，蒲 丹(昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650011)

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是代表人類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）最復(fù)雜的多態(tài)基因簇[1-2]，是一種可以識別所有有核細(xì)胞上同種異體抗原的表達(dá)分子[3]，可將抗原呈遞給淋巴細(xì)胞并啟動特異性免疫應(yīng)答，密切參與對病毒的免疫反應(yīng)[4]，尤其對多瘤病毒BK引起的BK病毒（BKV）相關(guān)腎病 (BKVAN)，也被認(rèn)為是腎移植患者移植物丟失的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素[5-6]。其中，HLAⅠ類分子呈遞的病毒肽與CD8+T細(xì)胞相互作用，而HLAⅡ類分子與CD4+T細(xì)胞相互作用[7]，在控制感染和誘導(dǎo)抗病毒免疫中起著關(guān)鍵作用。研究表明，CD4+T細(xì)胞在人類 BKV 感染中有充分的記錄，某些HLA等位基因可通過將抗原表位從保守的病毒蛋白優(yōu)先呈遞至免疫系統(tǒng)來提供保護(hù)或?qū)е虏《靖腥镜倪M(jìn)展減慢

[8]，直接參與抗BKV的免疫應(yīng)答。在腎移植中，受體免疫系統(tǒng)的主要目標(biāo)是供體細(xì)胞表面的HLA分子，因此，評估腎移植受者Ⅰ類和Ⅱ類HLA抗原有助于BKV篩查和早期的干預(yù)。云南地區(qū)HLA-B,HLA-DR等位基因與 BKV的相關(guān)性研究至今尚未見有報(bào)道，本文就HLA-B, HLA-DR等位基因與BKV之間的相關(guān)性展開分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月～2020年12月昆明市第一人民醫(yī)院腎移植科檢查BK病毒DNA的腎移植患者399例為研究對象，其中男性276例，女性123例，年齡3～70歲；通過實(shí)時定量聚合酶鏈方法檢測尿液BKV的DNA，其中感染組126例（尿液BKV DNA載量＞2.00×103copies/ml），尿液BKV陰性（BKV未感染組）273例（尿液BKV DNA載量＜2.00×103copies/ml或無Ct值）。兩組參與者均對實(shí)驗(yàn)知情同意，并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備：基因擴(kuò)增儀（BIOER，杭州博日儀器有限公司），多功能流式點(diǎn)陣儀（Luminex 200，美國Luminex公司），核酸濃度測定儀（Qbit4，賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑：血液基因組DNA提取試劑盒（DP348-02，北京天根生化科技有限公司），HLA-SSO LABType分型試劑盒（美國One lambda公司），Taq DNA聚合酶（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司）等。

1.3 方法 采集腎移植受者靜脈血2～3ml至EDTA-K2抗凝真空采血管充分混勻，用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，Qbit4測定DNA濃度并調(diào)整至15～25 ng/μl。配制PCR反應(yīng)體系（D-mix13.8μl/人份+Primer4μl/人份+DNA聚合酶0.2μl/人份+DNA2μl/人份，終體積為20μl），分別利用HLA-A，HLA-B，HLA-DR，HLA-DQ位點(diǎn)的不同引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)束后，將產(chǎn)物變性、中和，分別加入四種寡核苷酸探針標(biāo)記的微珠混勻，60℃雜交15min。雜交結(jié)束后，加入SAPE染料進(jìn)行染色，然后將雜交板轉(zhuǎn)移至 Luminex 200平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取，使用Fusion軟件進(jìn)行結(jié)果分析（具體操作步驟參照試劑說明書）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0（IBM公司）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Hardy-Weinberg 進(jìn)行吻合度檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，兩組間等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。進(jìn)行HLA-B，HLA-DR抗原與BKV感染的相關(guān)性分析，計(jì)算OR值及95%CI。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BKV感染組和對照組的 HLA-B 等位基因分布頻率 見表1。BKV感染組和BKV未感染組的HLA-B等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。BKV未感染組檢出的HLA-B等位基因有33種，其中占比大于10%的基因型有7種，分別為HLA-B*13（16.85%），HLA-B*46（19.41%），HLA-B*51（10.62%），HLA-B*55（10.62%），HLA-B*60（17.58%），HLA-B*62（24.91%）和HLA-B*75（16.48%）；BKV感染組中檢出的HLA-B等位基因有25種，其中占比大于10%的基因型有5種，分別為HLA-B*46（24.60%），HLA-B*55（10.32%），HLA-B*60（24.60%），HLA-B*62（22.22%）和HLA-B*75（15.87%）。BKV未感染組中HLA-B*13（16.85%）的頻率高于BKV感染組（8.73%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.642，P=0.031）。

表1 BKV感染組與BKV未感染組HLA-B等位基因的數(shù)量及分布頻率

2.2 BKV感染組和BKV未感染組的 HLA-DR 等位基因分布頻率 見表2。BKV感染組和BKV未感染組的 HLA-DR 等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。BKV未感染組檢出的 HLADR等位基因有14種，其中占比大于10%的基因型有7種，分別為 HLA-DR*4（30.40%），HLADR*8（15.75%）， HLA-DR*9（20.15%）， HLADR*11（12.45%），HLA-DR*12（42.12%）, HLADR*14（20.15%）， HLA-DR*15（25.27%）；BKV感染組中檢出的 HLA-DR等位基因有14種，其中占比大于10%的基因型有8種，分別為 HLADR*4（27.78%）， HLA-DR*8（18.25%）， HLADR*9（16.67%）， HLA-DR*11（11.11%），HLA-DR*12（42.86%），HLA-DR*13（11.90%），HLA-DR*14（23.81%），HLA-DR*15（19.84%）。BKV感染組中HLA-DR*17（9.52%）的頻率高于BKV未感染組（4.03%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.791，P=0.029）。

表2 BKV感染組與BKV未感染組HLA-DR等位基因的數(shù)量及分布頻率

2.3 HLA-B，HLA-DR抗原與BKV感染的相關(guān)性分析 進(jìn)一步比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的HLA-B等位基因和BKV感染的相關(guān)性。HLA-B*13是抗BKV的保護(hù)因子（χ2=4.285,P=0.031，OR=0.472，95%CI：0.236～0.946），HLA-DR*17是 抗BKV的危險(xiǎn)因素（χ2=4.791,P=0.029, OR=2.507, 95%CI:1.075～5.849）。

3 討論

隨著人類白細(xì)胞抗原（HLA）失配的減少，我們注意到BKV陽性的增加。BORNI-DUVAL等[3-4]在報(bào)道中提到BKV的患病率可高達(dá)20%。研究表明，特定的HLA等位基因可能與BKV感染的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。HLA等位基因參與BK抗原呈遞并引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞免疫介導(dǎo)的反應(yīng)。HLA I類分子在細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的幫助下對病毒有效，I類HLA分子可以有效抵抗病毒[8-10]。MASUTANI等人[6]發(fā)現(xiàn)HLA-A2，HLA-B44，HLA-C6，HLADR7，HLA -DR15和HLA -DR51匹 配 與 較 低 的BKV風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而KAVUZLU等[7]人最近的一項(xiàng)回顧性研究，表明了腎移植受者中 HLA-A，HLA-B和HLA -DR與BKV的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn) HLA-B*13等位基因具有保護(hù)性，使BKV感染幾率降低了86%。

很少有研究調(diào)查腎移植患者中HLA等位基因與BKV之間的關(guān)系，而HLA的錯配（不匹配）已經(jīng)成為BKVAN的危險(xiǎn)因素之一[11]，目前尚未有研究證實(shí)總體HLA失配與BKV腎病的發(fā)生之間有任何關(guān)聯(lián)[12]，但研究表明HLA對BKV感染的演變是雙向的。某些特定的 HLA等位基因可能是BKVAN的誘因[5]，而另一些則可能是保護(hù)性的[6]。由于HLA等位基因較多，此次研究選擇與BK感染方向一致的等位基因進(jìn)行相關(guān)性分析。通過近年的研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于不同民族間 HLA多態(tài)性與BKV相關(guān)性研究結(jié)果在不同地區(qū)、不同民族及人群中差異較大。因此，本研究選取云南地區(qū)BKV感染組和BKV未感染組，對HLA等位基因HLA-B，HLA -DR進(jìn)行檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明HLAⅠ類分子中的HLA-B*13等位基因是保護(hù)性因子（χ2=4.285，P=0.031，OR=0.472，95%CI：0.236～0.946），此結(jié)果與KAVUZLU等[7]的研究結(jié)果一致。同時云南地區(qū)人群感染BKV的機(jī)會可能與HLA-DR*17呈正相關(guān)，HLA-DR*17可 能 是BKV的 易 感 基 因（χ2=4.791,P=0.029，OR=2.507，95%CI：1.075～5.849），本研究結(jié)果說明，HLA-DR*17等位基因可能會增加BKV感染的風(fēng)險(xiǎn)。

影響B(tài)KV感染過程的人類白細(xì)胞抗原 (HLA)不僅能預(yù)測病毒尿自發(fā)消退或進(jìn)展為病毒血癥和相關(guān)腎病的可能性，還有助于制定 BKV早期篩查和干預(yù)措施，對最有可能患上疾病的患者進(jìn)行更頻繁的病毒檢測。最小化的降低免疫抑制劑的使用，并且在總體上改善患者和同種異體移植的結(jié)果，同時，研究HLA等位基因與BKV的相關(guān)性也為供-受者的選擇提供新的可能。為了更好地闡述BK感染與HLA基因型在不同人群中的關(guān)系,我們應(yīng)該加強(qiáng)全世界范圍內(nèi)的協(xié)作，擴(kuò)大 HLA上不同基因座位研究，增強(qiáng)對不同人群BKV感染與HLA相關(guān)性研究的探索，為BKV的防治尋找新的突破口，從而使人類從基因水平預(yù)防BKV感染，為治療BKV所致疾病提供可能。