范 寧，段雪紅，楊 瑜，王媛媛，魚麗萍，謝立民，王 苗

（咸陽市第一人民醫(yī)院a.檢驗科；b.神經(jīng)內(nèi)科，陜西咸陽 712000）

血流感染（blood stream infection，BSI）是一種嚴重的全身感染性疾病，發(fā)病率較高，可導致機體多器官功能障礙，嚴重者發(fā)生休克甚至死亡[1]。血培養(yǎng)是BSI診斷的金標準，快速、準確地確定病原菌信息，及時對癥用藥是臨床治療BSI的關鍵[2]。若在起病初期24～48h內(nèi)進行有效地抗生素治療，可明顯降低BSI的病死率[3]。然而，目前的血培養(yǎng)檢驗流程中，血培養(yǎng)瓶報陽后，仍需36～48h才能得到最終的菌種鑒定報告[4]。近年來，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix

assisted laser desorption ionization time of flight mass

spectrometry， MALDI-TOF MS）技術已應用于血培養(yǎng)陽性標本的直接鑒定。但由于標本前處理過程較復雜、不同菌種鑒定符合率有明顯差異，使其不能完全取代固體培養(yǎng)基的傳代培養(yǎng)。因此，本文針對陽性血培養(yǎng)，采用MALDI-TOF MS技術對分離膠促凝管聯(lián)合十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）前處理標本直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定相結合，探討血培養(yǎng)陽性標本中不同菌種快速鑒定的最佳時間。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2020年8月～2021年1月來源于咸陽市第一人民醫(yī)院微生物室的243瓶血培養(yǎng)陽性樣本進行分析。入選標準：BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀發(fā)出陽性報警，陽性瓶經(jīng)常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢確認為一種形態(tài)的細菌。排除標準：報陽血培養(yǎng)瓶經(jīng)常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)多種形態(tài)細菌和/或真菌。如同一患者同時多瓶血培養(yǎng)報陽，取最先報陽的血培養(yǎng)標本進行檢驗。

1.2 儀器與試劑 BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀，VITEK MS微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，VITEK 2 Compact微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國BioMrrieux公司）；哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；血培養(yǎng)瓶，MS P96孔靶板和CHCA基質(zhì)液，甲酸和乙腈（法國BioMrrieux公司）；十二烷基硫酸鈉和乙醇（天津市天力化學試劑有限公司）；革蘭染色液（珠海貝索生物技術有限公司）；分離膠促凝管（江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司）；大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國生物梅里埃公司提供。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)方法： BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀中的血培養(yǎng)瓶報陽后，轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱平板，經(jīng)35 ℃，5ml/dl CO2環(huán)境培養(yǎng)24h，取純菌落，采用VITEK MS或VITEK 2 Compact鑒定，并以此結果為金標準，比較SDS前處理和固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)應用MALDI-TOF MS鑒定的符合率。

1.3.2 分離膠促凝管聯(lián)合SDS前處理后 MALDITOF MS直接鑒定：標本前處理參照周春妹等[5]報道分離膠促凝管聯(lián)合SDS方法。MALDI-TOF MS鑒定按照VITEK MS操作程序進行。

1.3.3 固相培養(yǎng)基短時培養(yǎng)生長菌膜鑒定：取0.5ml血培養(yǎng)陽性樣本轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板上密集劃線，置35 ℃，5ml/dl CO2環(huán)境培養(yǎng)。分別取2h，4h和6h培養(yǎng)的菌膜采用VITEK MS鑒定。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。SDS前處理法直接鑒定和固體培養(yǎng)基短時菌膜鑒定符合率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定結果 見表1、表2。243例單一菌血培養(yǎng)標本，經(jīng)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)鑒定，分別為23種革蘭陰性菌153株（62.96%）和21種革蘭陽性菌90株（37.04%）。分離率前五位的細菌分別為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

表1 243例單數(shù)菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定結果

表2 各菌屬SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定結果及符合率[n（%）]

2.2 革蘭陽性菌(G+菌)和革蘭陰性菌（G-菌)SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 見表3。革蘭陽性菌中，SDS前處理法直接鑒定未鑒定出36株（40.00%，36/90），以葡萄球菌屬最多（30株），其中83.33%（25/30）為凝固酶陰性葡萄球菌。少見菌陰道加德納菌、藤黃微球菌、紋帶棒狀桿菌、單核細胞增生李斯特菌及溶血隱秘桿菌全部正確鑒定到種。

表3 G-菌和G+菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

革蘭陰性菌中，SDS前處理法直接鑒定錯誤2株（1.31%，2/153），為克氏檸檬酸桿菌和惡臭假單胞菌各1株。3株聚團泛菌鑒定結果較差，MALDITOF MS直接鑒定和6h菌膜分別鑒定正確1株；水生叢毛單胞菌僅6h生長菌膜鑒定正確，惡臭假單胞菌6h生長菌膜符合率為50%（1/2）；6株馬耳他布魯菌兩種鑒定方法均無結果，延長培養(yǎng)至8h可正確鑒定到屬。

除6h培養(yǎng)菌膜外，SDS前處理法直接鑒定和2h，4h生長菌膜鑒定，革蘭陰性菌符合率均高于革蘭陽性菌，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.880～37.808，均P＜0.01）。

2.3 腸桿菌和非發(fā)酵菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 見表4。腸桿菌鑒定符合率均高于非發(fā)酵菌，僅4h培養(yǎng)菌膜鑒定比較差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=4.993，P＜0.05）,其余差異均無統(tǒng)計學意義。

表4 腸桿菌和非發(fā)酵菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

2.4 主要革蘭陽性菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率 腸球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率比較見表5。金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌鑒定符合率比較見表6。金黃色葡萄球菌SDS前處理法直接鑒定和2h，4h生長菌膜鑒定符合率均高于凝固酶陰性葡萄球菌，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.795，12.083, 9.035，均P＜0.01）。

表5 主要革蘭陽性菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

表6 金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌SDS前處理法直接鑒定與固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)菌膜鑒定符合率（%）比較

3 討論

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(MALDI-TOF MS)是目前微生物實驗室的常用工具，可顯著縮短病原菌的鑒定時間[6]。與傳統(tǒng)方法相比，通過MALDI-TOF MS從陽性血培養(yǎng)標本中直接鑒定微生物，可明顯縮短鑒定時間[7]。此方法需要對樣品進行濃縮和純化，包括離心和洗滌、選擇性裂解血細胞、血清分離或過濾等過程。目前，國外已有三個主要的商品試劑盒[8]用于血培養(yǎng)陽性標本的前處理。

雖然商品試劑盒易于標準化，但由于試劑盒成本高等原因，國內(nèi)實驗室多采用自制試劑用于血液標本的處理[2,5，9-12]。本研究參考周春妹等[5]分離膠管聯(lián)合SDS改良法處理標本，采用MALDI-TOF MS直接鑒定，結果與文獻[5]比較，革蘭陽性菌的符合率較低，其它結果基本一致。主要為凝固酶陰性葡萄球菌鑒定符合率低，這與侯偉偉等[2]的研究結果一致，高于方毅等[13]的結果?？偡下逝c分離膠管聯(lián)合Bruker質(zhì)譜直接鑒定[3,10,14]結果也一致。分離率前五位的細菌除表皮葡萄球菌外，其余四種菌直接鑒定符合率均大于70%，其中肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌為100%?？梢?，采用自制試劑處理標本，通過MALDI-TOF MS技術，可準確鑒定血流感染的主要病原菌。

美國運用溶解過濾法處理標本，同時使用處理后過濾器上的細菌直接制備菌懸液，聯(lián)合VITEK 2 Compact進行藥敏試驗，使得血培養(yǎng)瓶報陽到鑒定及藥敏試驗的中位時間縮短至9.9h[15]。BROYER等[6]通過自動化處理，實現(xiàn)了靶板制備的標準化，提高了種鑒定水平，同時可“按需”和“小批量”操作，節(jié)省了時間和人力。谷鈺峰等[16]將MALDITOF MS技術與流式細胞學聯(lián)合應用于BSI病原體的快速鑒定及藥敏試驗，使得報告時間更縮短至3h以內(nèi)。自動化的標本前處理操作，可顯著提高MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性標本的準確率,聯(lián)合前處理純化菌液快速藥敏試驗可為臨床抗感染治療提供更快更可靠的依據(jù)。

不同菌種，SDS前處理法MALDI-TOF MS直接鑒定的符合率存在差異?？偟膩碚f，革蘭陰性菌高于革蘭陽性菌，原因可能為血培養(yǎng)中革蘭陽性菌污染概率大于革蘭陰性菌，而污染菌的菌量比較少，且革蘭陽性菌有較厚的難被破壞的細胞壁，從而導致VITEK MS直接法鑒定準確率低[2]。凝固酶陰性葡萄球菌的鑒定符合率明顯低于金黃色葡萄球菌，對于二者具有一定的鑒別診斷意義[11]。HAMILTON等[17]研究結果顯示，對于血培養(yǎng)中未能直接鑒定的葡萄球菌，在低風險或低流行率地區(qū)，可排除金黃色葡萄球菌菌血癥。林曉暉等[18]利用VITEK MS 的 Launch pad 軟件對細菌所產(chǎn)生的質(zhì)譜峰質(zhì)荷比（M/Z）進行分析，可快速鑒別甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)及 甲 氧 西 林 敏感的金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，為抗感染治療提供更精準的依據(jù)。

由于血培養(yǎng)報陽時間不一致，批處理不能實現(xiàn)快速鑒定，單獨處理樣本相對費時費力。加之凝固酶陰性葡萄球菌、某些革蘭陰性菌及一些少見菌等，SDS前處理法直接鑒定效果不佳，故本研究同時利用MALDI-TOF MS鑒定血平板上短時生長菌膜，以進一步縮短陽性血培養(yǎng)鑒定時間和鑒定符合率。

文獻[19]報道，血培養(yǎng)陽性標本中的革蘭陰性桿菌采用MALDI-TOF MS成功鑒定菌種的平均時間僅為2.0h，而革蘭陽性球菌為5.9h。本研究結果顯示，革蘭陰性菌2h菌膜鑒定符合率為59.48%，低于直接鑒定結果；而革蘭陽性菌6h菌膜鑒定符合率達86.67%，高于直接鑒定結果。故對于革蘭陰性菌本研究結果直接鑒定效果更佳，而革蘭陽性菌6h菌膜鑒定符合率更高。二者4h菌膜鑒定符合率與MALDI-TOF MS直接鑒定的數(shù)據(jù)接近，其中腸桿菌科細菌與金黃色葡萄球菌的鑒定符合率最高，非發(fā)酵菌低于腸桿菌，可能與其在固體培養(yǎng)基生長相對較慢有關。6h生長菌膜與吳富煒等[20]的研究結果一致,高于HA等[21]的研究結果。周道紅等[22]報道革蘭陽性菌4h菌膜與革蘭陰性菌2h菌膜鑒定結果均高于本研究，可能與病原菌數(shù)量及菌種分布有關。

相比于MALDI-TOF MS直接鑒定，固體培養(yǎng)基短時生長菌膜質(zhì)譜鑒定不需要特殊試劑和標本處理，可通過隨時查看培養(yǎng)基上菌膜生長狀態(tài)即時鑒定，更適宜對單個或小批量樣本的鑒定。結合本研究結果及血液培養(yǎng)技術用于BSI診斷臨床實踐專家共識[23],本研究團隊建議：①血培養(yǎng)報陽后首選MALDI-TOF MS直接鑒定，約85%的革蘭陰性菌及60%的革蘭陽性菌可在1～2h內(nèi)被準確鑒定到種；②對于鑒定失敗的革蘭陽性球菌，直接選擇6h生長菌膜進行鑒定，因為2h和4h生長菌膜鑒定符合率并不優(yōu)于直接鑒定。對于鑒定失敗的葡萄球菌，若本地區(qū)金黃色葡萄球菌BSI率較低，可提示臨床金黃色葡萄球菌感染的可能性不大。③對于未能進行直接鑒定的標本，革蘭陰性菌可選擇2h生長菌膜進行鑒定，如失敗再對4h生長菌膜進行鑒定。革蘭陽性球菌則培養(yǎng)至4h鑒定，如失敗再對6h生長菌膜進行鑒定；④報陽時長大于2天且曲線平緩者建議直接選擇6h生長菌膜鑒定，如報陽曲線及涂片結果疑似布魯菌，則培養(yǎng)至8h再鑒定。

MALDI-TOF MS已被證明是一種快速、可靠的直接鑒定血培養(yǎng)瓶中病原體的方法[24]。本研究結果表明，MALDI-TOF MS技術可對BSI主要病原菌進行快速直接鑒定，根據(jù)革蘭染色結果聯(lián)合固體培養(yǎng)基短時培養(yǎng)生長菌膜質(zhì)譜鑒定，可進一步縮短細菌鑒定時間，為臨床抗感染治療提供早期依據(jù)。