葉嘉豪， 李 琳， 鐘森杰， 楊 夢(mèng)， 胡志希

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 長(zhǎng)沙 410208)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指心肌收縮力下降導(dǎo)致心排血量降低、組織和器官血液灌注量下降，不能滿足機(jī)體代謝需求，從而出現(xiàn)肺循環(huán)或(和)體循環(huán)障礙的臨床綜合征，是各種心血管疾病的終末階段[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界CHF發(fā)病率高達(dá)2%，僅美國(guó)就有500萬(wàn)人患病[2]，因其具有高發(fā)病率、高死亡率等特點(diǎn)，已成為世界性危害公共健康問(wèn)題。目前臨床主要運(yùn)用β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑等治療CHF，通過(guò)抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度激活改善心室重構(gòu)、延緩慢性心衰發(fā)展，但總體療效不理想，且長(zhǎng)期服藥具有一定的毒副作用[3]，因此，迫切需要尋找一種療效好、副作用小的治療方案。中醫(yī)在治療CHF的過(guò)程中積累了相當(dāng)豐富的經(jīng)驗(yàn)[4-7]，并能和西藥聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高療效。臨床常用真武湯治療CHF，但具體作用機(jī)制尚不完全清楚[8，9]。本研究通過(guò)觀察真武湯對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9的影響，探究真武湯對(duì)抗心室重構(gòu)的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療CHF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)LL2020060401)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，自由進(jìn)食飲水，12 h光照周期。

1.2 藥物及制備

茯苓(批號(hào)CX20091402)、白芍(批號(hào)TH20080602)、白術(shù)(批號(hào)NG20090401)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；附子(安徽亳藥干草中藥飲片有限公司，批號(hào)DX200201)、生姜(當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，批次20191022)經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉杰研究員鑒定為正品。真武湯遵循原方組成，將附子、茯苓、白芍、生姜、白術(shù)按照3∶3∶3∶3∶2比例浸泡于裝有無(wú)菌飲用水的陶罐中，浸泡后煎煮2次，每次30 min，藥液合并后濃縮為生藥含量1 g/mL，4 ℃冰箱保存[10]。阿霉素(美國(guó)APExBIO公司，貨號(hào)A39662337769)；酒石酸美托洛爾片(國(guó)藥準(zhǔn)字H32025391，貨號(hào)0902066，25 mg/片)，阿斯利康藥業(yè)中國(guó)有限公司。

1.3 試劑與儀器

Caspase-3、Caspase-9 Elisa檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E08857r、CSB-E08863r)；Caspase-3、Caspase-9、TIMP-1抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab13847、ab52298、ab61224)；MMP-1、GAPDH抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)10371-1-AP、10494-1-AP)。

SonoScape-S2N 型彩超儀，深圳開(kāi)立科技公司；H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；PW-812型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40 D型轉(zhuǎn)膜儀，北京六一生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、美托洛爾組、真武湯組，每組6只。正常組大鼠每周腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其余大鼠每周腹腔注射阿霉素1次，質(zhì)量濃度為2 mg/mL，給藥劑量為0.15 mL/100 g體質(zhì)量[11]。7周后，以FS<30%為慢性心衰造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[12]。造模成功后，美托洛爾組(2 mg/mL，10 mg/kg)和真武湯組(1 g/mL，18 g/kg)連續(xù)28 d灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

28 d給藥結(jié)束后，用彩超儀于大鼠左心室長(zhǎng)軸切面進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)及左心室短軸縮短率(fractional shortening,FS),每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次取平均值。

1.6 取材

各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行深度麻醉(0.35 mL/100 g)，剖開(kāi)胸腔切取全心，取左心室-80 ℃保存。

1.7 Elisa法檢測(cè)心肌組織Caspase-3、Caspase-9含量

采用Elisa法檢測(cè)各組大鼠心肌組織Caspase-3、Caspase-9含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.8 Western blot法檢測(cè)心肌組織Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1蛋白表達(dá)

剪取適量左心室心尖組織，BCA法檢測(cè)蛋白定量，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉, 以Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)、MMP-1(1∶1000)、TIMP-1(1∶1000)孵育一抗，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶6000)，ECL顯色、曝光，掃描底片并用Quantity one軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較

表1示，模型組大鼠FS值<30%，說(shuō)明CHF造模成功。與空白組比較，模型組大鼠EF、FS值顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，真武湯組與美托洛爾組大鼠EF、FS值顯著上升(P<0.01)，說(shuō)明真武湯與美托洛爾均能改善大鼠的心功能。

2.2 Elisa法檢測(cè)各組大鼠心肌Capsase-3、Caspase-9含量比較

表2示，與空白組比較，模型組大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，真武湯組與美托洛爾組大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與美托洛爾組比較，真武湯組大鼠的Caspase-3含量顯著降低(P<0.01)。

2.3 各組大鼠心肌組織Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1蛋白水平比較

表3圖1示，與空白組比較，模型組大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9、MMP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，TIMP-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，真武湯組和美托洛爾組大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9和MMP-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，TIMP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與美托洛爾組比較，真武湯組大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05),TIMP-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。

注：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)-1圖1 各組大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1免疫印跡圖

3 討論

CHF屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“水腫”“喘證”等范疇[13]，病位在心，與肺、脾、腎相關(guān),屬于本虛標(biāo)實(shí)之證。患者由于心腎陽(yáng)氣虧虛，水液運(yùn)化失常，導(dǎo)致瘀血、痰飲內(nèi)停，而瘀血、痰飲等病理產(chǎn)物又能損耗心腎陽(yáng)氣，故治療時(shí)應(yīng)以“溫補(bǔ)陽(yáng)氣，活血利水”為主[14，15]。真武湯源于《傷寒論》，是溫陽(yáng)利水的代表方劑，主治陽(yáng)虛水泛證。方中附子溫腎壯陽(yáng)，化氣利水為君；白術(shù)健脾燥濕，使水有所制；茯苓淡滲利滲，使水濕從小便而去，并助白術(shù)健脾，二者共為臣藥；生姜溫中散寒，既助附子溫陽(yáng)散寒又合茯苓、白術(shù)宣散水濕；芍藥一則利小便行水，二則柔肝緩急止痛，三則斂陰舒筋防止筋肉瞤動(dòng),四則防止溫燥藥物耗傷陰津[16]，與生姜共為佐藥。現(xiàn)代藥理研究表明，真武湯能通過(guò)興奮下丘腦-垂體-腎上腺、下丘腦-垂體-甲狀腺、降低一氧化氮與內(nèi)皮素含量,延緩心衰進(jìn)程，并通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓與水通道蛋白，起到調(diào)節(jié)水液平衡的作用[17-19]。

阿霉素是一種從真菌菌株中提取的廣譜高效的蒽醌類抗腫瘤藥物，具有抑制DNA和RNA合成、殺滅各生長(zhǎng)周期腫瘤細(xì)胞的作用。阿霉素與心肌有較強(qiáng)的親和性，具有一定的心臟毒性，其毒性機(jī)制包括自由基產(chǎn)生、線粒體損傷、心肌壞死、凋亡等，從而引起心室重構(gòu)最終導(dǎo)致CHF[20-22]。目前常利用阿霉素制備CHF的大鼠模型，具有廉價(jià)、簡(jiǎn)單、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

心室重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展的基本病理環(huán)節(jié)，目前影響心室重構(gòu)的因素有心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)改變、細(xì)胞凋亡過(guò)程等[23]，ECM的功能主要是維持心肌細(xì)胞的排列和協(xié)調(diào)心肌收縮性，ECM的合成和降解失衡是導(dǎo)致心室重構(gòu)的主要因素之一[24]，而MMPs主要負(fù)責(zé)ECM的降解或重構(gòu)過(guò)程。其中MMP-1為MMPs家族中的核心因子，正常情況下MMP-1表達(dá)水平極低，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、腫瘤侵襲擴(kuò)散等因素刺激情況下，MMP-1表達(dá)水平則顯著增加，進(jìn)而增加對(duì)膠原基質(zhì)的降解，導(dǎo)致心肌重構(gòu)[25]。 而心肌TIMPs家族能抑制MMPs活性，以1∶1的比例與MMPs形成復(fù)合體，進(jìn)而阻斷MMPs進(jìn)入膠原基質(zhì)，抑制心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，其中TIMP-1與MMP-1具有高度親和性，二者之間的平衡在慢性心衰心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制主要包括死亡受體通路、線粒體通路等，線粒體通路主要與Caspase-9和Caspase-3相關(guān)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子刺激等情況時(shí)，形成的凋亡復(fù)合體會(huì)激活 Caspase-9，使其具有酶切活性，然后繼續(xù)活化下游的Caspase-3，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27，28]，其中Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，它的活化說(shuō)明細(xì)胞凋亡進(jìn)程已發(fā)展至不可逆的階段[29-31]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的心肌Caspase-3、 Caspase-9、MMP-1水平顯著升高，而TIMP-1的蛋白表達(dá)顯著降低，表明阿霉素能夠通過(guò)引起心肌細(xì)胞凋亡、提高M(jìn)MP-1表達(dá)以及降低TIMP-1表達(dá)促進(jìn)心室重構(gòu)。真武湯能有效抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控MMP-1、TIMP-1含量，改善心肌重構(gòu)，延緩心衰進(jìn)程，且改善心肌重構(gòu)程度明顯優(yōu)于美托洛爾。

超聲心動(dòng)圖作為目前檢測(cè)心功能、結(jié)構(gòu)改變的方法之一，臨床常用于檢測(cè)心衰嚴(yán)重程度，其中EF及FS為心功能常見(jiàn)指標(biāo)[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，真武湯組大鼠的EF、FS值顯著提高，說(shuō)明真武湯具有增強(qiáng)心肌收縮力、提高射血分?jǐn)?shù)進(jìn)而改善心功能的作用。

本研究通過(guò)觀察真武湯對(duì)阿霉素構(gòu)建CHF大鼠心室重構(gòu)的影響，證實(shí)真武湯能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，調(diào)控MMP-1和TIMP-1的含量，增強(qiáng)心肌收縮力和射血分?jǐn)?shù)，進(jìn)而改善心功能，延緩心衰發(fā)展的進(jìn)程。本研究可為臨床應(yīng)用真武湯治療CHF提供實(shí)驗(yàn)支持。