薛艷君， 吳嬌娟， 張旭東， 蔚鵬程， 吳小麗， 劉清國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 北京 100029)

高血壓是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高為主要特征(收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg)，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征，其發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢(shì)，而知曉率、治療率和控制率相對(duì)較低[1-3]。臨床常以口服降壓藥作為控制血壓的主要方式，但長期服藥會(huì)出現(xiàn)心率失常、頭暈、面部潮紅等多種不良反應(yīng)[4-6]，不如針刺療法安全有效。研究顯示，針刺太沖穴降壓效果明顯，且能夠有效改善高血壓帶來的心腦血管損傷[7-9]。在高血壓狀態(tài)下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在明顯的氧化與抗氧化失衡現(xiàn)象[10]。中樞氧化應(yīng)激與高血壓疾病關(guān)系密切，但其機(jī)制相關(guān)研究卻甚少。相關(guān)文獻(xiàn)表明[11]，高血壓可以導(dǎo)致海馬的氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激程度的重要標(biāo)志物[12]。因此，本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)為模型，以電針雙側(cè)“太沖”為干預(yù)方式，通過觀察SHR大鼠海馬組織形態(tài)以及海馬中MDA、SOD、GSH-Px的含量變化，探討電針“太沖”對(duì)高血壓海馬氧化應(yīng)激水平的影響。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)BUCM-4-2018061501-2058)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級(jí)Wistar-Kyoto(WKY)大鼠6只，SPF級(jí)SHR大鼠12只，9周齡雄性，體質(zhì)量(220±15) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (京) 2006-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由取食及飲水。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑廠，302-17-0)；PBS緩沖液(廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司，SH3026.01)；MDA(A003-1)、SOD(A001-3)、GSH-Px(A005-50)ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所。

HANS-200E韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司；BX53自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Leica超薄切片機(jī)(RM2235)、全自動(dòng)脫水機(jī)(ASP200 S)、烤片臺(tái)(HI1220)，德國徠卡公司；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；20PR -52D高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司。

1.3 干預(yù)方法

“太沖”穴取穴方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(林文柱、王佩編)[13]，于后肢足背1，2跖骨凹陷處取“太沖”穴。電針組右手為刺手，直刺雙側(cè)“太沖”穴1～2 mm，連接韓式電針儀兩極，連續(xù)等幅波，電流強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz，留針20 min，治療14 d，每日1次。針刺時(shí)間集中在每天下午2∶00～4∶00;模型組和空白組每日在相同時(shí)間與針刺組進(jìn)行相同的捉抓固定刺激。

1.4 動(dòng)物分組及取材

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將12只SHR大鼠按照完全隨機(jī)數(shù)字表法等分為電針組和模型組各組6只，6只WKY大鼠作為空白組。禁食12 h后大鼠稱重，用10%水合氯醛(300 mg/kg)注射腹腔進(jìn)行麻醉，麻醉成功后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，迅速斷頭、剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，取出腦組織放入冰生理鹽水中清洗，去除其中的血液后迅速剝離出海馬組織，取部分海馬組織于4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，置于4 ℃冰箱保存，用于常規(guī)蘇木精伊紅(HE)染色；剩余海馬組織裝于標(biāo)記好的EP管，迅速投入液氮中，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化

將海馬組織于甲醛溶液中取出，蒸餾水沖洗干凈，予以酒精浸泡脫水，二甲苯透明1 h，浸蠟常規(guī)包埋，用切片機(jī)將蠟塊切成4 μm薄片，60 ℃烘烤12 h，將切片依次置于二甲苯中20 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min 75%乙醇5 min，于蒸餾水中浸洗，用蘇木素染細(xì)胞核8 min，蒸餾水洗后用0.6%氨水返藍(lán)，再用伊紅染細(xì)胞質(zhì)4 min，酒精脫水后用二甲苯透明樹膠封片，最后將切片置于光鏡下(×400)觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.6 Elisa法檢測(cè)海馬區(qū)MDA、SOD、GSH-Px含量

將海馬組織和生理鹽水按1∶9比例制備10%的腦組織勻漿，后取勻漿于離心機(jī)離心20 min(3000 r/min，離心半徑13.5 cm)，取上層清液配制成適當(dāng)?shù)臐舛?，?yán)格按照MDA、SOD、GSH-Px試劑盒說明書步驟操作，測(cè)定其在海馬組織中的活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬齒狀回區(qū)HE染色結(jié)果

圖1示，采用光鏡下(×400)觀察各組大鼠海馬齒狀回區(qū)組織形態(tài)變化，結(jié)果顯示空白組細(xì)胞呈圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，染色均一，多數(shù)細(xì)胞核深染，核仁清晰；與空白組比較，模型組染色明顯變淺，出現(xiàn)細(xì)胞溶解碎裂、核固縮、空泡樣變性等。與模型組比較，電針組細(xì)胞染色加深，核仁較清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。

圖1 各組大鼠海馬齒狀回區(qū)HE染色(×400)

2.2 各組大鼠海馬中MDA、GSH含量檢測(cè)結(jié)果

表1示，與空白組比較，模型組的MDA含量顯著提升(P<0.01)，SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，電針組MDA含量明顯下降(P<0.05)，SOD含量明顯上升(P<0.05)，GSH-Px含量顯著上升(P<0.01)。

表1 各組大鼠大腦海馬組織MDA、SOD、GSH-Px含量比較

3 討論

SHR與人類原發(fā)性高血壓的形成機(jī)制相似，是目前公認(rèn)的最接近人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，廣泛應(yīng)用于人類高血壓病發(fā)病機(jī)制及高血壓藥物的篩選[14]。SHR大鼠易激惹、易緊張，眼球突出明顯，毛色發(fā)黃無光澤，小便偏黃、大便偏干等，具有典型的中醫(yī)辨證分型肝火上炎證表現(xiàn)[15]。太沖穴最早見于《靈樞·本輸》：“太沖，行間上二寸陷者之中也”，為足厥陰肝經(jīng)之原穴，是臟腑精氣的留止部位。同時(shí)太沖穴又是四關(guān)穴之一，是氣血陰陽離合出入的要道。因此太沖穴具有平肝潛陽、疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝的功效，是治療高血壓的首選穴之一[16-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)以SHR大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選取太沖穴作為治療穴。

氧化應(yīng)激參與高血壓海馬組織損傷[21]，受高血壓影響，腦部的活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量明顯增加，這些活性氧與腦部的脂肪酸結(jié)合，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[22，23]，高血壓可以引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，嚴(yán)重?fù)p傷海馬神經(jīng)，引起腦部微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。有學(xué)者通過動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast enhancement magnetic resonance imaging, DCE-MRI)及免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，高血壓狀態(tài)下海馬區(qū)血腦屏障通透性、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)、β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein, Aβ)等物質(zhì)發(fā)生異常改變[24]。

MDA是氧自由基作用于生物膜中的不飽和脂肪酸，是發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，常用的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的重要生理指標(biāo)[25]，可以引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，能加劇細(xì)胞膜的損傷，通過檢測(cè)MDA可以了解機(jī)體的氧化水平。SOD和GSH-Px均為抗氧化物酶，能抵抗氧化損傷。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，能夠清除生物氧化過程中的超氧陰離子自由基，被認(rèn)為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[26]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，具有特異性催化還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)對(duì)過氧化氫的反應(yīng)，防止自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害，是機(jī)體抗氧化能力指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)[27-30]，MDA含量的增加，SOD與GSH-Px含量的降低均與高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。且針刺可以通過降低SHR大鼠體內(nèi)MDA含量，提升SOD、GSH-Px含量，提高機(jī)體抗氧化能力，最終實(shí)現(xiàn)降壓目的[31-33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針作用于SHR大鼠雙側(cè)“太沖”，可以顯著降低MDA的表達(dá)水平，提升SOD、GSH-Px的表達(dá)水平，提示電針“太沖”可通過調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH-Px的表達(dá)水平。

綜上，海馬中MDA含量的增加，SOD、GSH-Px含量的減少可能是高血壓發(fā)病的中樞機(jī)制之一。電針“太沖”可以通過下調(diào)MDA、上調(diào)SOD和GSH-Px來改善海馬的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)海馬組織，這可能是電針降壓的中樞機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)著重于氧化應(yīng)激對(duì)高血壓海馬損傷的相關(guān)機(jī)制尚有不足，關(guān)于針刺降壓的中樞氧化應(yīng)激機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。