包程公， 楊永菊， 馬賢德， 鄭 曲， 張 宇， 關(guān)雪峰△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 沈陽(yáng) 110032)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)屬于慢性退行性關(guān)節(jié)病，主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨退變以及關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)增生[1]。OA多見(jiàn)于中老年人群，女性較男性更多，資料顯示該病在我國(guó)>40歲人群中的發(fā)病率達(dá)10%～17%，并且隨著肥胖人口增加和人口老齡化發(fā)展，其發(fā)病率逐年升高[2]。關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)不利等為OA主要表現(xiàn)，晚期可致殘。臨床多采用非甾體類(lèi)抗炎藥、保護(hù)軟骨藥物等對(duì)癥治療，但副作用明顯且無(wú)法控制其進(jìn)展[3]，目前亟需尋找更為安全有效的藥物。中醫(yī)認(rèn)為OA屬于“痹證”“骨痹”范疇[4]，多由年老腎陽(yáng)不足、又感受風(fēng)、寒、濕外邪、氣血瘀滯所致，治療以溫補(bǔ)腎陽(yáng)、化瘀除痹為原則，針灸、中藥復(fù)方、中成藥等多種方法治療該病取得了較好的效果[5-7]。右歸丸是溫補(bǔ)腎陽(yáng)法的代表方，在OA的臨床治療中療效肯定[8]，但其相關(guān)作用機(jī)制尚未完全明確。本次研究以Janus激酶(janus kinase，JAK)2/信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討右歸丸對(duì)OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響。本研究通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)21000042021052)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，8周齡，體質(zhì)量240～280 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2019-0001。將大鼠分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度、濕度分別保持在(21±1)℃和(50±5)%，晝夜交替時(shí)間為12 h，保證充足飲水與標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

右歸丸藥物組成：熟地黃24 g，鹿角膠、山藥、杜仲、菟絲子各12 g，山茱萸、當(dāng)歸、枸杞子各9 g，附子、肉桂各6 g，購(gòu)自遼寧省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，煎煮并制成濃度為2 g/mL的右歸丸藥液，4 ℃冰箱保存。塞來(lái)昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20140072，每粒0.2 g)采用0.9%氯化鈉溶液制成0.4 mg/mL塞來(lái)昔布懸液，即用即配。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)GOY-9884)、通用SP檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)GOY-D12592)，上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；HE染色試劑盒(貨號(hào)H1200KT)、DAB顯色試劑盒(貨號(hào)YDJQ3587)、ECL試劑盒(貨號(hào)YDJQ3429)，上海羽哚生物科技有限公司；PVDF膜(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)3010040001)；BCA試劑盒(南京萊富賽生物科技有限公司，貨號(hào)PA001)；兔抗大鼠JAK2，STAT3、B淋巴細(xì)胞瘤(B-lymphoma，Bcl)-2、Bcl-XL關(guān)聯(lián)XL蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax-XL)抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、山羊抗兔二抗，貨號(hào)分別為FNab04432、FNab08299、FNab00840、FNab00811、FNab00873、FNab09778，武漢菲恩生物科技有限公司。

DCM8型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica公司；ELITE300PLUS型垂直電泳儀、E-Blotter型濕轉(zhuǎn)槽，美國(guó)WEALTEC公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥方法

隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組12只和造模組36只。全部大鼠仰臥固定，1.5 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉之后打開(kāi)右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔，造模組剪斷內(nèi)側(cè)副韌帶和前后交叉韌帶，驗(yàn)證前抽屜試驗(yàn)呈陽(yáng)性，同時(shí)將內(nèi)側(cè)半月板完整摘除；假手術(shù)組僅打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，不進(jìn)行其他操作；青霉素沖洗創(chuàng)口后縫合。術(shù)后給予青霉素肌肉注射3 d抗感染。術(shù)后第2 天開(kāi)始，定時(shí)驅(qū)趕動(dòng)物以強(qiáng)迫其活動(dòng)后肢30 min，每日1次[9]。6周后，假手術(shù)組取1只大鼠、造模組取2只大鼠，采用HE染色法觀(guān)察患肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織，判定模型是否建立成功。

造模過(guò)程中有1只大鼠死亡。將造模成功的33只大鼠分為模型組、右歸丸組及塞來(lái)昔布組各11只。模型組、假手術(shù)組分別給予0.9%氯化鈉溶液，右歸丸組給予2 g/mL右歸丸溶液，塞來(lái)昔布組給予0.4 mg/mL 塞來(lái)昔布懸液，各組大鼠均灌胃給藥，體積為10 mL/kg，連續(xù)8周。

2.2 標(biāo)本采集與處理

末次干預(yù)后第2天麻醉處死大鼠，完整取出患側(cè)膝關(guān)節(jié)的軟骨組織，洗滌后切取1/2置于10%甲醛內(nèi)固定，14 h后取出置于脫鈣液內(nèi)處理24 h，石蠟包埋，切片機(jī)制成5 μm切片，以備HE、免疫組化以及TUNEL染色觀(guān)察；另外1/2軟骨組織凍存于-80 ℃冰箱，以備Western blot檢測(cè)。

2.3 HE染色法觀(guān)察大鼠軟骨形態(tài)

將軟骨組織石蠟切片取出，常規(guī)采用二甲苯處理脫蠟，100%～95%～85%乙醇依次處理水化，之后HE試劑盒染色、脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察染色結(jié)果并拍照，參照文獻(xiàn)采用Mankin評(píng)分評(píng)估各組軟骨損傷情況[10]。

2.4 TUNEL染色法觀(guān)測(cè)大鼠軟骨組織細(xì)胞凋亡情況

取軟骨組織石蠟切片并脫蠟、水化，3%H2O2處理3 min。按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、脫水、透明、封片[11]，采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并采集圖像。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，對(duì)切片中隨機(jī)5個(gè)視野的凋亡細(xì)胞、總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并取平均值。細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)

取軟骨組織石蠟切片，抗原修復(fù)，3% H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，5%牛血清白蛋白溶液封閉，分別用JAK2(1∶200)、STAT3(1∶100)、Bcl-2(1∶200)、Bcl-XL(1∶100)一抗工作液處理2 h，山羊抗兔二抗工作液(1∶100)處理1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片[11]。采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色，計(jì)數(shù)JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率并取平均值。

2.6 Western blot法測(cè)定大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)

將凍存的軟骨組織剪碎加入細(xì)胞裂解液，BCA法確定總蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上；封閉后分別用JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜；山羊抗兔二抗(1∶3000)室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯色[12]。

采用ImageLab軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL灰度值與β-actin的比值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠軟骨組織病理學(xué)觀(guān)察

圖1示，HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞呈水平排列，關(guān)節(jié)軟骨邊緣光滑；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨層細(xì)胞變薄、排列紊亂，軟骨下骨增生，可見(jiàn)脫水固縮壞死的軟骨細(xì)胞，各層軟骨結(jié)構(gòu)無(wú)法分辨；右歸丸組和塞來(lái)昔布組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞排列偶欠規(guī)整，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.右歸丸組；D.塞來(lái)昔布組圖1 各組大鼠軟骨組織病理學(xué)結(jié)果比較(HE染色 ×200)

表1示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨Mankin評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸組及塞來(lái)昔布組大鼠軟骨Mankin評(píng)分降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠軟骨Mankin評(píng)分比較

3.2 各組大鼠軟骨組織AI比較

表2圖2示，TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨AI明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸組及塞來(lái)昔布組大鼠軟骨AI明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠軟骨組織AI比較

圖2 各組大鼠軟骨組織細(xì)胞凋亡結(jié)果(TUNEL染色 ×200)

3.3 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL陽(yáng)性表達(dá)率比較

表3圖3示，免疫組化染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，右歸丸組及塞來(lái)昔布組大鼠軟骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：Janus激酶(Janus kinase，JAK)2，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3，B淋巴細(xì)胞瘤(B-lymphoma，Bcl)-2，Bcl-2關(guān)聯(lián)XL蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax-XL)圖3 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL免疫組化染色結(jié)果(×400)

3.4 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)水平比較

表4圖4示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，右歸丸組及塞來(lái)昔布組大鼠軟骨JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)水平比較

注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.右歸丸組；4.塞來(lái)昔布組；Janus激酶(Janus kinase，JAK)2，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3，B淋巴細(xì)胞瘤(b-lymphoma，Bcl)-2，Bcl-2關(guān)聯(lián)XL蛋白(bcl-2 associated X protein，Bax-XL)圖4 各組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL 免疫印跡結(jié)果

4 討論

OA的發(fā)生與年齡、創(chuàng)傷、肥胖、過(guò)度負(fù)重等有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為主要涉及基質(zhì)金屬蛋白酶降解、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、水通道蛋白等多個(gè)方面[13-15]，其中軟骨細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變、鈣化，對(duì)關(guān)節(jié)功能造成不良影響，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)而阻斷關(guān)節(jié)退變對(duì)于OA的防治具有重要意義，也是新藥研究的主要方向之一。

OA屬于中醫(yī)“痹證”“骨痹”“痿證”范疇，常見(jiàn)病機(jī)為腎陽(yáng)不足、氣血瘀滯。本研究針對(duì)此病機(jī)采用溫補(bǔ)腎陽(yáng)之右歸丸治療。右歸丸方中附子溫陽(yáng)散寒止痛，肉桂溫陽(yáng)通脈、散寒止痛，鹿角膠有填精養(yǎng)血、溫補(bǔ)肝腎之效[16]，三者相配能補(bǔ)腎中元陽(yáng)并溫中驅(qū)寒，是為君藥；熟地黃填精益髓、滋陰養(yǎng)血；枸杞滋肝補(bǔ)腎；山藥既補(bǔ)腎固精養(yǎng)陰又益脾肺之氣；山茱萸補(bǔ)肝益腎，四者養(yǎng)陰補(bǔ)腎健脾，取“陰中求陽(yáng)”之意，是為臣藥；再加杜仲補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，當(dāng)歸補(bǔ)血活血止痛，菟絲子補(bǔ)益肝腎3味佐藥，全方共奏溫腎補(bǔ)陽(yáng)、益精填血之效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，鹿角膠中的多肽、氨基酸等有效成分可抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損軟骨修復(fù)，還能抗炎鎮(zhèn)痛[17]；當(dāng)歸有改善微循環(huán)的藥理作用，亦能減少軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎緩解[18]。由此可見(jiàn)，用右歸丸治療OA具有一定的理論基礎(chǔ)。本研究成功建立了OA大鼠模型，模型組大鼠軟骨組織出現(xiàn)與人類(lèi)OA類(lèi)似的病理變化，Mankin評(píng)分升高，軟骨細(xì)胞AI也顯著增加，證實(shí)OA存在軟骨損傷及細(xì)胞凋亡增多的情況；而經(jīng)右歸丸治療后，大鼠Mankin評(píng)分、軟骨細(xì)胞AI均低于模型組，且與塞來(lái)昔布組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明右歸丸能夠有效減輕OA引起的軟骨組織損傷程度，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，發(fā)揮較好的治療效果。

本研究從JAK/STAT3信號(hào)通路入手，分析右歸丸發(fā)揮作用的具體機(jī)制。JAK/STAT3信號(hào)通路廣泛參與機(jī)體炎癥及細(xì)胞分化、凋亡及炎癥反應(yīng)過(guò)程，與OA的發(fā)病關(guān)系密切。JAK及相關(guān)受體、STAT為該通路關(guān)鍵成分，可將細(xì)胞外化學(xué)信號(hào)處理后傳遞給細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、損傷、凋亡等重要基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。劉軍等[19]對(duì)OA小鼠模型軟骨細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白分組檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡對(duì)軟骨細(xì)胞線(xiàn)粒體的抗氧化應(yīng)激能力有增強(qiáng)作用，而該通路參與軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程。胡炯等[20]檢測(cè)OA模型大鼠及健康大鼠關(guān)節(jié)軟骨中磷酸化-JAK2、磷酸化-STAT3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與健康大鼠比較，OA大鼠的JAK2/STAT3信號(hào)通路被顯著抑制，軟骨細(xì)胞凋亡速度提高。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，右歸丸組及塞來(lái)昔布組大鼠軟骨組織JAK2、STAT3、Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)均高于模型組，Bcl-2和Bcl-XL均屬于抗凋亡蛋白，對(duì)各種原因誘發(fā)的細(xì)胞凋亡均有抑制作用。該結(jié)果證實(shí)，右歸丸能夠激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，上調(diào)軟骨組織Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。這可能是右歸丸治療OA的機(jī)制之一。

綜上所述，右歸丸能夠有效減輕OA大鼠軟骨組織損傷，減少軟骨細(xì)胞凋亡，其作用可能與激活JAK/STAT3信號(hào)通路、上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)有關(guān)。