王添全， 歐陽(yáng)競(jìng)鋒， 荊志偉， 劉 蔚， 胡金濤， 曹俊嶺， 郭明冬

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 北京 102488；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院學(xué)術(shù)管理處， 北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院， 北京 100078；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院， 北京 100700；6.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院， 北京 100091)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)指由腦血管病變所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，是最常見(jiàn)的非變性病癡呆，占癡呆患者的15%～20%[1]，其患者總數(shù)僅次于阿爾茲海默病。VD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及神經(jīng)遞質(zhì)水平變化、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、自噬、遺傳、突觸損傷、氧自由基損傷和炎癥損傷等[2]，其中突觸損傷日益受到關(guān)注。研究表明，在VD發(fā)病早期突觸損傷就已存在，且不同程度的缺血缺氧也會(huì)導(dǎo)致突觸超微結(jié)構(gòu)的變化[3]。在短期腦缺血中僅少量樹突會(huì)消失[4]，而長(zhǎng)期的缺氧缺血?jiǎng)t能迅速導(dǎo)致軸突和樹突消融，突觸數(shù)量減少，突觸間隙也隨之增寬[5]。VD突觸損傷導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能破壞，使突觸可塑性下降。課題組前期研究表明，戟天健腦方治療輕度VD有良好效果[6]。本研究利用低糖低氧環(huán)境誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突觸損傷，觀察戟天健腦方對(duì)突觸可塑性的影響，及其對(duì)環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通路相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究戟天健腦方的治療機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2020XLC012-2)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD乳鼠(出生72 h內(nèi))50只，6～8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。乳鼠用于提取海馬神經(jīng)元細(xì)胞，大鼠用于制備含藥血清。大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中，保持動(dòng)物每日正常作息規(guī)律，自由進(jìn)食飲水。

1.2 飲片與藥物

戟天健腦方組成：酒茱萸12 g，遠(yuǎn)志10 g，紅景天15 g，巴戟天12 g，茯苓20 g，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部主任曹俊嶺教授鑒定為正品；尼莫地平片(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33022285，批號(hào)1901001)。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)11965-092)、DMEM低糖培養(yǎng)基(貨號(hào) 11885-084)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，貨號(hào)10099-141)、谷氨酰胺(貨號(hào) 25030-081)、青鏈霉素雙抗(貨號(hào) 15140-122)，美國(guó)gibco公司；突觸素(synaptophysin，Syn,貨號(hào)ab161606)、突觸后膜致密物質(zhì)95(postsynaptic density 95，PSD-95,貨號(hào)ab18258)、突觸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein43，GAP-43,貨號(hào)ab75810)、甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2，MecP2,貨號(hào)ab50005)、三磷酸鳥苷酶活化蛋白(p250 GTPase activating protein，p250GAP,貨號(hào)ab150847)、DAPI染色封片液(貨號(hào)ab104139)，英國(guó)abcam公司；兔二步法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PV-9001)、鼠二步法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PV-9002)，北京中杉金橋生物科技有限公司；免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC(貨號(hào) P0186)、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555(貨號(hào) P0179)，上海碧云天生物科技有限公司；CREB ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)36001)，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；BDNF ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)DBNT00)，美國(guó)Bio-techne公司；神經(jīng)組織分離試劑盒(貨號(hào)130-094-802)，德國(guó)Miltenyi Biotec公司。

R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦公司；6-16K型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)sigma公司；SynergyH1型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AE2000型倒置生物顯微鏡，廈門麥克奧迪光學(xué)儀器有限公司；371型恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；3131型三氣培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；130-096-427型自動(dòng)恒溫分離器，德國(guó)Miltenyi Biotec公司。

1.4 藥液制備及溶液配制

1.4.1 戟天健腦方提取液制備 取戟天健腦方組方10劑共690 g，加8倍量水浸泡30 min煎煮1 h, 過(guò)濾收集藥液，將殘?jiān)俅渭?倍量水煎煮1 h收集藥液。合并2次藥液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將藥液濃縮至約575 mL，制備為藥液濃度為1.2 g/mL的戟天健腦方提取液。

1.4.2 尼莫地平溶液制備 尼莫地平片每片20 mg，取5片研磨成粉末加去離子水至20 mL配成濃度為5 mg/mL尼莫地平溶液。

1.5 含藥血清的制備

SD大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、高劑量組、中劑量組、低劑量組及尼莫地平組、空白組10只，其余各組每組5只。按成人等效劑量計(jì)算出大鼠戟天健腦方的用藥劑量為5 g/kg/d，則高劑量組為10 g/kg/d，低劑量組為2.5 g/kg/d，尼莫地平溶液給藥劑量為50 mg/kg/d，空白組給等量0.9%氯化鈉溶液。各組分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次共7 d，末次灌胃2 h后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，將所得血液在室溫下靜置 2 h，離心機(jī)設(shè)定4 ℃，離心半徑15 cm，3000 r/min離心 10 min，取上清即為戟天健腦方高、中、低劑量含藥血清，尼莫地平含藥血清和空白血清。

1.6 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

超凈臺(tái)內(nèi)操作。選取出生3 d內(nèi)清潔級(jí)SD大鼠，75%酒精對(duì)大鼠頭、頸、上胸部進(jìn)行消毒，斷頸取頭，固定頭部，從中線剪開頭部至嗅球，暴露大腦皮質(zhì)，根據(jù)腦立體定位圖譜分離出海馬組織置于PBS溶液中，去除腦膜和脈絡(luò)叢，用無(wú)菌眼科剪將海馬組織剪塊，試劑盒酶解。所得細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后棄上清液，加入適量含10%FBS、1%L-谷氨酰胺、1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL)的 DMEM高糖培養(yǎng)基，吹打混勻制成單細(xì)胞混懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞混懸液密度，于24孔板中放置細(xì)胞爬片并接種1 mL混懸液，使密度達(dá)4×105個(gè)/孔。常規(guī)(37 ℃、5%CO2和飽和濕度)條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞，至細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%，即得正常大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞。

1.7 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞低糖低氧模型建立及干預(yù)

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、戟天健腦方高、中、低劑量組6組。吸去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL含10%相應(yīng)藥物的含藥血清。正常組培養(yǎng)條件保持不變，模型組培養(yǎng)基中加入空白血清，陽(yáng)性組加入尼莫地平含藥血清，戟天健腦方高、中、低劑量組加入相應(yīng)劑量的含藥血清。放入提前預(yù)溫的培養(yǎng)箱(換為93% N2、5% CO2和2% O2混合氣體，仍37 ℃、飽含濕度)中培養(yǎng)6 h，正常氧條件下恢復(fù)20 h。收集細(xì)胞上清液，加入4%組織固定液固定，取固定好的各組細(xì)胞進(jìn)行HE染色以觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 觀察指標(biāo)及方法

1.8.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化觀察 取1.6項(xiàng)下已固定的細(xì)胞共6組，每組3個(gè)復(fù)孔，采用HE染色法進(jìn)行染色。加入PBS緩沖液清洗3次后，加入蘇木素染色后酸化返藍(lán)，再加入1%伊紅水溶液染色，脫水封片，使用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)進(jìn)行圖片收集。

1.8.2 各組細(xì)胞中MecP2、p250GAP、PSD-95蛋表達(dá) 取1.6中已固定的細(xì)胞共6組，每組3個(gè)復(fù)孔，采用免疫組化二步法進(jìn)行染色。用含0.025% TRITON-100的TBS溶液洗滌透化，5% BSA溶液常溫封閉1 h，一抗孵育(PSD-95、MecP2、p250GAP抗體濃度均為1∶200)，4 ℃水平搖床上過(guò)夜，加相應(yīng)二抗孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片，使用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)掃描載玻片。使用Image J 1.53軟件測(cè)算各指標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物的光密度值(optical density，OD)。

1.8.3 各組細(xì)胞中GAP-43、Syn蛋白表達(dá)位點(diǎn)觀察 取1.6項(xiàng)下已固定的細(xì)胞共6組，每組3個(gè)復(fù)孔，采用免疫熒光染色法。用含0.025% TRITON-100的TBS溶液洗滌透化，5% BSA溶液常溫封閉1 h，一抗孵育(GAP-43、Syn抗體濃度均為1∶200)，4 ℃水平搖床上過(guò)夜，二抗改用熒光二抗(GAP-43使用Alexa Fluor 555紅色熒光二抗、Syn使用FITC綠色熒光二抗，二抗?jié)舛葹?∶1000)避光孵育1 h，用含DAPI的明膠封片劑封片，使用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)掃描載玻片。使用Image J 1.53測(cè)算平均灰度值(mean gray value)作為平均熒光強(qiáng)度。

1.8.4 各組細(xì)胞中CREB、BDNF含量 采用 ELISA法檢測(cè)，按照說(shuō)明書方法收集各組細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，其中CREB含量使用細(xì)胞裂解液檢測(cè)、BDNF含量使用細(xì)胞上清檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞HE染色結(jié)果

圖1示，HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組中細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)輪廓模糊呈不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞核腫大松散甚至水解凋亡。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及戟天健腦方高、中、低劑量組細(xì)胞形態(tài)清晰，軸突細(xì)長(zhǎng)明顯，細(xì)胞核較為圓潤(rùn)，說(shuō)明低糖低氧模型能損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞，而戟天健腦方具有一定保護(hù)作用。

注：C(Control)：空白組；Mo(Model)：模型組；P(Positive)：陽(yáng)性組；L(Low)：戟天健腦方低劑量組；M(Medium)：戟天健腦方中劑量組；H(High)：戟天健腦方高劑量組圖1 各組海馬細(xì)胞形態(tài)觀察比較(HE染色×200)

2.2 MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表達(dá)水平比較研究

圖2表1示，各組細(xì)胞中MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表達(dá)水平，與空白組比較，模型組細(xì)胞中MecP2、PSD-95的表達(dá)明顯減少，p250GAP的表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性組及戟天健腦方高、中、低劑量組中MecP2、PSD-95蛋白表達(dá)均明顯增加，p250GAP蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

注：甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2，MecP2)；三磷酸鳥苷酶活化蛋白(p250 GTPase activating protein，p250GAP)；突觸后膜致密物質(zhì)95(postsynaptic density 95，PSD-95)；C(Control)：空白組；Mo(Model)：模型組；P(Positive)：陽(yáng)性組；L(Low)：戟天健腦方低劑量組；M(Medium)：戟天健腦方中劑量組；H(High)：戟天健腦方高劑量組圖2 各組細(xì)胞MecP2、p250GAP、PSD-95免疫組化染色結(jié)果(×200)

表1 各組細(xì)胞MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較(OD值，

2.3 GAP-43、Syn蛋白表達(dá)位點(diǎn)比較研究

圖3、4示，各組細(xì)胞中GAP-43、Syn蛋白表達(dá)，藍(lán)色熒光為DAPI染色，主染細(xì)胞核；紅綠熒光為二抗結(jié)合點(diǎn)，即蛋白表達(dá)位點(diǎn)。由合并(merge)圖可以看出，紅綠熒光主要分布在藍(lán)色熒光周邊，即GAP-43、Syn蛋白表達(dá)位點(diǎn)在核周突觸位置。

注：突觸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein43，GAP-43)；C(Control)：空白組；Mo(Model)：模型組；P(Positive)：陽(yáng)性組；L(Low)：戟天健腦方低劑量組；M(Medium)：戟天健腦方中劑量組；H(High)：戟天健腦方高劑量組；-B(Blue)：藍(lán)色熒光通道；-R(Red)：紅色熒光通道；-B-R：藍(lán)紅熒光通道合并(merge)圖3 各組細(xì)胞GAP-43蛋白表達(dá)位點(diǎn)觀察比較(免疫熒光染色×200)

注：突觸素(synaptophysin，Syn)；C(Control)：空白組；Mo(Model)：模型組；P(Positive)：陽(yáng)性組；L(Low)：戟天健腦方低劑量組；M(Medium)：戟天健腦方中劑量組；H(High)：戟天健腦方高劑量組；-B(Blue)：藍(lán)色熒光通道；-G(Green)：綠色熒光通道；-B-G：藍(lán)綠熒光通道合并(merge)圖4 各組細(xì)胞Syn蛋白表達(dá)位點(diǎn)觀察比較(免疫熒光染色×200)

表2示，各組細(xì)胞中GAP-43、Syn蛋白表達(dá)水平，與空白組比較，模型組細(xì)胞中GAP-43、Syn蛋白表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性組及戟天健腦方高、中、低劑量組中GAP-43、Syn蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，且隨戟天健腦方劑量的提高，Syn蛋白表達(dá)也在增強(qiáng)。

表2 各組細(xì)胞GAP-43、Syn蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度比較

2.4 CREB、BDNF含量比較研究

表3示，與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)CREB、BDNF含量均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性組及戟天健腦方高、中、低劑量組中CREB、BDNF含量均明顯增加(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組細(xì)胞中CREB、BDNF含量比較

3 討論

VD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆病”等范疇，其發(fā)病機(jī)制與年老腎精虧虛、腦脈不充、痰濁瘀血阻竅密切相關(guān)。正如《醫(yī)學(xué)心悟》所言：“腎主智，腎虛則智不足?！蹦I虛則易生痰，痰瘀互結(jié)、痰濁蒙竅則為癡呆。如《慎柔五書》載：曾有人病癡……此心系、腦絡(luò)、脊髓之間有瘀痹之脈，阻其神機(jī)不能靈轉(zhuǎn)也，此乃痰閉陽(yáng)氣之病。本病好發(fā)于中風(fēng)病之后，中風(fēng)形成的痰濁、瘀血等產(chǎn)物留于腦竅形成巢囊，影響腦神而致智能障礙,因此補(bǔ)腎化濁開竅是血管性癡呆的主要治法。

戟天健腦方由巴戟天、酒茱萸、紅景天、茯苓、遠(yuǎn)志等組成。方中巴戟天補(bǔ)腎填精健腦，酒茱萸補(bǔ)肝益腎，澀精固脫，共為君藥；茯苓健脾化濁寧神；遠(yuǎn)志化痰開竅安神益智，共為臣藥，佐以紅景天益氣活血，解毒健腦，諸藥合用補(bǔ)腎健腦，化濁開竅，神清智定。前期臨床研究證實(shí)，戟天健腦方對(duì)輕度VD患者療效確切，能顯著改善患者的認(rèn)知能力和日常生活狀態(tài)，增加患者乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活力，同時(shí)降低乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)活性[7]。

CREB/BDNF通路在神經(jīng)元保護(hù)與再生、突觸形成及學(xué)習(xí)記憶改善等方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[8]。CREB能刺激基因轉(zhuǎn)錄，是一種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，主要調(diào)節(jié)突觸可塑性相關(guān)蛋白的合成，CREB在路徑中既可正向抑制下游p250GAP蛋白合成，又可反向提高上游MeCP2蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶，在通路里具有承上啟下的作用[9]。BDNF作為重要的神經(jīng)生長(zhǎng)因子之一，直接參與海馬神經(jīng)元的發(fā)生，維持神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與發(fā)育，是學(xué)習(xí)和記憶形成的基礎(chǔ)。另外BDNF能促進(jìn)突觸可塑性相關(guān)蛋白的合成，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2通路來(lái)提高CREB的表達(dá)[10]。CREB、BDNF既可以作為調(diào)控突觸可塑性的重要因子，又能與多種靶基因或相關(guān)蛋白相互作用形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)突觸形態(tài)變化和可塑性過(guò)程。本研究采用戟天健腦方干預(yù)低糖低氧條件下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，結(jié)果顯示模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞中CREB、BDNF含量大量減少，戟天健腦方各劑量組CREB、BDNF含量增加，說(shuō)明戟天健腦方能夠介導(dǎo)CREB/BDNF通路蛋白表達(dá)，從而參與大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷保護(hù)。MeCP2是甲基化結(jié)合蛋白的一種，可以特異性結(jié)合甲基化的DNA，作為通路的上游，MeCP2的增強(qiáng)可顯著提高BDNF含量，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育成熟、突觸生長(zhǎng)和可塑性調(diào)節(jié)[11]。p250GAP是CREB/BDNF通路的下游基因，參與底物的水解，水解后的底物又參與路徑啟動(dòng)相關(guān)反應(yīng)，p250GAP表達(dá)的抑制能夠保證突觸形態(tài)的穩(wěn)定及正常的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。免疫組化結(jié)果顯示，戟天健腦方可以使MeCP2表達(dá)增強(qiáng)，p250GAP表達(dá)減弱，二者作為CREB/BDNF通路的上下游蛋白，說(shuō)明戟天健腦方對(duì)MeCP2，p250GAP的調(diào)控能夠參與到CREB/BDNF信號(hào)通路中，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

突觸可塑性是指突觸的形態(tài)和功能在長(zhǎng)時(shí)間可調(diào)節(jié)的特性，反映出神經(jīng)元對(duì)環(huán)境的適應(yīng)以及發(fā)生功能性改變的能力。PSD-95主要位于突觸后膜上，能夠參與突觸后膜上多種信號(hào)傳遞，與蛋白特異性結(jié)合參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)[13，14]。GAP-43作為突觸前膜蛋白，參與神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細(xì)胞損傷后再生，在神經(jīng)元發(fā)育和再生過(guò)程中以高水平表達(dá)，發(fā)揮突觸可塑性調(diào)節(jié)作用，是神經(jīng)再生的特異性標(biāo)志[15]。Syn不僅是突觸前囊泡膜上固有的鈣結(jié)合蛋白，與突觸囊泡的釋放密切相關(guān)[16，17]，還是突觸前成分常用的標(biāo)記物，參與突觸結(jié)構(gòu)的維持、神經(jīng)的可塑性。其表達(dá)能夠間接表現(xiàn)突觸密度和數(shù)量，反映突觸可塑性。本研究結(jié)果顯示，戟天健腦方能增強(qiáng)以上突觸相關(guān)蛋白表達(dá)，尤其是GAP-43及Syn蛋白，而模型組中各指標(biāo)蛋白表達(dá)均明顯減弱，說(shuō)明戟天健腦方可以通過(guò)調(diào)節(jié)突觸膜上相關(guān)特征蛋白來(lái)修復(fù)低糖低氧引起的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷，其中以戟天健腦方高劑量的結(jié)果最為顯著，具有一定的量效關(guān)系。綜上所述，戟天健腦方可以通過(guò)激活CREB/BDNF通路調(diào)節(jié)低糖低氧條件下大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸可塑性，其機(jī)制可能為通過(guò)調(diào)節(jié)MeCP2、p250GAP蛋白,提高CREB、BDNF含量，促進(jìn)PSD-95、GAP-43及Syn蛋白表達(dá)，減緩?fù)挥|損傷，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。

本研究以“癡呆”病因病機(jī)和戟天健腦方臨床治則為理論基礎(chǔ)，探討戟天健腦方對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸可塑性的影響，觀察到戟天健腦方能有效減緩?fù)挥|損傷，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，并猜想與CREB/BDNF通路調(diào)節(jié)表達(dá)有關(guān)，為治療血管性癡呆提供了新的思路。