于甜甜，楊 燕，趙珊珊，郭 凱，殷金崗，林夢君，崔本文，姬勝利

（潤輝生物技術(shù)<威海>有限公司，山東 威海 264207）

皮膚衰老是多種因素引起的退行性過程，與慢性炎癥有著密切聯(lián)系。隨著年齡的增長，體內(nèi)氧化還原平衡能力失調(diào)，激活促炎信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎介質(zhì)（如IL-1、IL-6和TNF-α等）水平不斷提高。多聚脫氧核糖核酸（polydeoxyribonudeotid，PDRN）來自于三文魚精子，是分子量在50～1500 KDa的脫氧核糖核酸聚合物，具有組織修復(fù)、抗炎、促血管生長等多種活性功能。在韓國、日本、歐洲等國家，PDRN已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、醫(yī)療器械等各個(gè)領(lǐng)域中。PDRN由脫氧核糖核酸酶酶解，產(chǎn)生單脫氧核苷酸或寡脫氧核苷酸，通過激活嘌呤能受體，來刺激成纖維細(xì)胞增殖、遷移、血管生成以及核酸的合成，從而促進(jìn)傷口愈合。PDRN還是一種A2A受體激動(dòng)劑，該受體的刺激可以減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，有效抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)，同時(shí)可以降低瘢痕的形成。PDRN的制備方法有很多，但大多都存在一定的缺陷。現(xiàn)有制備PDRN技術(shù)的提取收率低，在較高溫度下使用酸降解DNA降低分子量的過程中需高溫反應(yīng)條件以及加堿中和和超聲波分解破碎過程中產(chǎn)生局部高溫，易發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)品顏色發(fā)黃，影響產(chǎn)品質(zhì)量。潤輝生物技術(shù)<威海>有限公司對上述制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用了溫和的酶切法制備PDRN，此方法可以去除部分導(dǎo)致過敏反應(yīng)的嘌呤堿基，增加產(chǎn)品的安全性，同時(shí)可提高收率，解決高溫易降解、產(chǎn)品易泛黃等問題。本研究主要對PDRN的工藝改進(jìn)及其功效進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器材料 PDRN（批號(hào)：RN01-211211），潤輝生物技術(shù)<威海>有限公司；地塞米松（批號(hào)：WXBD3340V），Sigma；脂多糖（LPS，批號(hào)：820F036），北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)：WH0021D231），武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)：21090701），浙江天杭生物科技有限公司；CCK-8細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；Mouse IL-6 ValukineTMELISA（批號(hào)：600404），R&D；Mouse TNF-alpha ValukineTM ELISA（批號(hào)：600409），R&D；小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7），武漢普諾賽生物科技有限公司；L929小鼠成纖維細(xì)胞，武漢普諾賽生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco；胰蛋白酶（批號(hào)：2022020401），安琪酵母。儀器：搪瓷反應(yīng)釜（淄博慶冠化工設(shè)備銷售有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；萬能粉碎機(jī)（江陰市祥達(dá)機(jī)械制造有限公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma）；生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）。

1.2 PDRN制備工藝 在專利報(bào)道的基礎(chǔ)上，對關(guān)鍵步驟進(jìn)一步優(yōu)化，以控制PDRN分子量范圍和雙鏈的完整性，保持高生物活性。溶液配制：混合鹽溶液1：0.15 mol/L的NaCl，0.03 mol/L的檸檬酸鈉，0.5%的NaHSO，pH為8.0；混合鹽溶液2：0.15 mol/L的NaCl，0.03 mol/L的檸檬酸鈉，pH為8.0；混合鹽溶液3：0.15 mol/L的NaCl，0.5 mmol/L的EDTA。

1.2.1 魚精巢預(yù)處理 將冷庫內(nèi)冷凍保存的約500 g大馬哈魚魚精巢取出，于室溫下解凍；再用去離子水洗滌2次；最后使用粉碎機(jī)對魚精巢進(jìn)行粉碎處理，將魚精巢徹底粉碎成漿糊狀。

1.2.2 魚精細(xì)胞收集 將1.2.1中得到的漿糊狀處理物按照1∶2（m/v）的比例加入混合鹽溶液1中，于室溫?cái)嚢? h，將上述溶液以6000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清，再使用混合鹽溶液2將沉淀洗滌5次，離心獲得含魚精細(xì)胞的沉淀物。

1.2.3 酶解魚精細(xì)胞中的魚精蛋白 在37 ℃下，將含魚精細(xì)胞的沉淀物按照1∶25（m/v）的比例加入混合鹽溶液3中攪拌均勻；按照魚精巢原料質(zhì)量與胰蛋白酶質(zhì)量為250∶1的比例加入至反應(yīng)體系中，并在50 ℃下酶解10 h。

1.2.4 魚精巢DNA上清液收集 在步驟1.2.3的反應(yīng)體系中加入魚精巢原料重量9%的SDS、最終濃度為1.6 mol/L的NaCl，持續(xù)攪拌3～5 h后離心沉淀，收集上清液。

1.2.5 魚精巢DNA收集 將步驟1.2.4中的洗脫液按照2.5∶1的體積比加入至預(yù)先冷卻的無水乙醇中攪拌，使絮狀的DNA析出，并漂浮于溶液上層；將上述的DNA取出，采用75%乙醇水溶液洗滌、離心5次，將得到的DNA沉淀粉碎，經(jīng)凍干處理得到DNA白色固體。

1.2.6 PDRN獲取 將步驟1.2.5中的DNA溶解在37 ℃的去離子水中，形成10 g/L的溶液；將脫氧核糖核酸酶加入至反應(yīng)體系中形成3 mg/L的溶液，并在37 ℃下反應(yīng)2 h；加入9%的SDS（w/v）、終濃度為1.6 mol/L的NaCl溶液，繼續(xù)攪拌4 h后離心除沉淀，收集上清液；上清液按照體積比為2∶1的比例加至預(yù)冷的無水乙醇中攪拌0.5 h，將溶液以6000 rpm的轉(zhuǎn)速離心1 h，棄上清；用75%乙醇水溶液將沉淀洗滌、離心4次后，將得到的DNA沉淀粉碎，進(jìn)行凍干得到白色固體，即為PDRN。

采用上述制備工藝生產(chǎn)PDRN，計(jì)算其收率，并對其性狀、蛋白質(zhì)、細(xì)菌內(nèi)毒素、含量、收率以及增色效應(yīng)等進(jìn)行觀察和檢驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞毒性及功效研究試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞毒性檢測方法 按照96孔板布局，在每個(gè)細(xì)胞孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，每孔中的細(xì)胞量為1×10個(gè)細(xì)胞。于37 ℃、5%的CO、濕潤條件下培養(yǎng)24 h。根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)組：空白對照組、溶劑對照組、樣品組，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。小鼠單核巨噬細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基作為受試物溶劑，樣品組設(shè)置5個(gè)樣品濃度：0.078、0.156、0.313、0.625和1.250 mg/ml。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，干預(yù)24 h后，采用CCK-8法進(jìn)行檢測，孵育時(shí)間為2 h，于450 nm檢測吸光值。計(jì)算相對細(xì)胞活力，相對細(xì)胞活力大于70.00%時(shí)，說明樣品對細(xì)胞無毒性。相對細(xì)胞活力（A-A）/（A-A）×100%，其中：As為樣品組吸光值；An為溶劑對照組吸光值；Ab為空白組吸光值。

表1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 抗炎功效評價(jià) 通過體外建立LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞模型，加入樣品干預(yù)刺激過程，考察樣品是否能抑制炎性因子IL-6和TNF-α的分泌，從而達(dá)到抗炎功效。LPS溶液：稱取LPS粉末5 mg，溶于1 ml培養(yǎng)基中，混勻，0.22 μm濾膜過濾除菌，得5 mg/ml母液，-20 ℃冰箱保存。臨用前用培養(yǎng)基稀釋至1 μg/ml。取處于對數(shù)生長期的Raw264.7細(xì)胞，以1×10個(gè)/ml密度接種于24孔板，在37 ℃、5%的CO條件下培養(yǎng)24 h，加入樣品，每孔1 ml，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用Mouse IL-6 Valukine TMELIAS和Mouse TNFalpha ValukineTM ELISA試劑盒分別檢測細(xì)胞中的IL-6和TNF-α的含量。結(jié)果判斷：樣品組與NC組相比，樣品組的IL-6和TNF-α表達(dá)量顯著降低，即可表明樣品具有一定抗炎功效。

表2 抗炎功效評價(jià)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 促傷口愈合功效試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用originPro8.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)處理組的平均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），使用單向方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，方差齊性使用Levene檢驗(yàn)，多重比較使用Fisher LSD檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 自制PDRN檢驗(yàn)結(jié)果 自制PDRN三批收率均大于10.00%，增色效應(yīng)大于30.00%，分子量在100～300 KDa范圍內(nèi)，檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 PDRN檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 以PDRN的濃度為橫坐標(biāo)，相對細(xì)胞活力值為縱坐標(biāo)，繪制相對細(xì)胞活力曲線，結(jié)果顯示隨著PDRN 濃度增加，相對細(xì)胞活力逐漸降低，樣品濃度在1.250 mg/ml時(shí)，相對細(xì)胞活力為86.53%，見圖1。

圖1 相對細(xì)胞活力曲線

2.3 抗炎功效的評價(jià)結(jié)果 與NC組比較，0.313 mg/ml、0.625 mg/ml和1.250 mg/ml樣品組的IL-6表達(dá)量降低（＜0.05），且在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三個(gè)樣品濃度下，樣品的濃度與IL-6表達(dá)量呈劑量依賴型關(guān)系，見圖2。與NC組比較，0.625 mg/ml和1.250 mg/ml樣品組的TNF-α表達(dá)量降低（＜0.05），且在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)樣品濃度下，樣品的濃度與TNF-α表達(dá)量呈劑量依賴型關(guān)系，見圖3。

圖2 不同處理對IL-6含量的影響

圖3 不同處理對TNF-α含量的影響

2.4 促傷口愈合功效的評價(jià)結(jié)果 與BC組比較，0.1 mg/ml的PDRN對劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移有一定的促進(jìn)作用，可減小劃痕面積；5 mg/ml的PDRN細(xì)胞劃痕面積無減小趨勢，見表5、圖4。

表5 劃痕面積和細(xì)胞遷移率結(jié)果

圖4 不同試驗(yàn)分組的檢測結(jié)果

3 討論

目前，PDRN在國外廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，對PDRN的質(zhì)量要求也越來越高。潤輝生物技術(shù)<威海>有限公司依托于天然海洋生物資源，對PDRN工藝進(jìn)行研究、改進(jìn)，以提高PDRN的產(chǎn)品質(zhì)量為目的，提高產(chǎn)品收率、降低經(jīng)濟(jì)成本。PDRN具有多種活性功能，其抗炎、舒緩、促修復(fù)功能尤為強(qiáng)大，國內(nèi)化妝品市場尚未全面開放應(yīng)用，本研究旨在為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

本研究對三批自制PDRN 進(jìn)行了考察檢驗(yàn)，結(jié)果顯示酶解法制備的PDRN，三批收率分別為10.23%、11.61%和11.22%，增色效應(yīng)為36.01%、32.04%和42.82%，提示其收率大幅度提高，增色效應(yīng)符合要求，與經(jīng)典分子量（50～1500 KDa）相比，自制PDRN的分子量范圍穩(wěn)定的控制在100～300 KDa，并且解決了高溫易泛黃的問題，保證質(zhì)量的同時(shí)還提高了產(chǎn)品的安全性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，0.625 mg/ml和1.250 mg/ml樣品組的TNF-α表達(dá)量降低（＜0.05），提示PDRN在0.078～1.250 mg/ml的濃度范圍內(nèi)，相對細(xì)胞活力為86.53～108.90%，大于70.00%，因此上述濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性?？寡坠πгu價(jià)結(jié)果顯示，與NC組比較，0.313 mg/ml、0.625 mg/ml和1.250 mg/ml樣品組的IL-6表達(dá)量降低（＜0.05），提示0.313 mg/ml、0.625 mg/ml和1.250 mg/ml的PDRN可以有效抑制炎癥因子IL-6的表達(dá)量，并且0.625 mg/ml和1.250 mg/ml的PDRN可以有效抑制TNF-α的表達(dá)量。促傷口愈合功效評價(jià)結(jié)果表明，0.1 mg/ml的PDRN具有明顯的促成纖維細(xì)胞遷移的能力，而5 mg/ml的PDRN具有明顯抑制成纖維細(xì)胞遷移的能力，因此在較低濃度時(shí)，PDRN表現(xiàn)出促進(jìn)傷口愈合的能力。

綜上所述，改進(jìn)后生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的PDRN具有抗炎及促傷口愈合的功效，且作用效果明顯。