何弢 譚志巍 王喬羽 謝雨芹 龔劉萍 張燕琴 劉沙,△

（1.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院，四川 成都 610057；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500；3.空軍第986 醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710054）

肺癌是全球高發(fā)病癥，并且致死率很高，我國(guó)肺癌患病人數(shù)在2015 年就達(dá)到了73.33 萬[1]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（Nonsmall-cell lung cancer，NSCLC），其 中 以NSCLC 最為常見，占所有肺癌種類的 85%-90%[2]。非小細(xì)胞肺癌早期癥狀不明顯，確診時(shí)多為晚期，外科手術(shù)已經(jīng)不適宜作為治療手段，因?yàn)榻?jīng)過手術(shù)切除治療的非小細(xì)胞肺癌患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，術(shù)后病人的總體生存率也較低[1]。而NSCLC 的分子靶向治療取得了明顯的進(jìn)展，例如厄洛替尼對(duì)NSCLC 有很強(qiáng)的抑制作用[3]，索拉菲尼在NSCLC 的I 和II 期臨床實(shí)驗(yàn)中取得了較滿意效果[4]。因此更好的挖掘NSCLC 發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)理對(duì)于開發(fā)抗NSCLC 藥物具有較強(qiáng)臨床價(jià)值。

研究表明 G 蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptor,GPCRs）屬于七次跨膜受體，參與了多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程，與許多人類疾病的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有密切的聯(lián)系，是一種重要的細(xì)胞表面受體，CALCR 屬于GPCRs 其中之一[5]。CALCR（也稱為CTR），位于染色體7q21.3上，既是降鈣素激素受體，也是細(xì)胞外鈣傳感器，是一種具有雙重功能的跨膜肽[6,7]。但是CALCR在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)文獻(xiàn)資料極少，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)CALCR 在NSCLC 組織中的表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

細(xì)胞自噬是一個(gè)重要的細(xì)胞代謝過程之一，可作為NSCLC 的治療靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，其功能主要是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，此過程通過清除損壞的蛋白或細(xì)胞器來完成[8]。研究表明細(xì)胞自噬在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程中起雙重調(diào)控作用。一方面通過維持基因組穩(wěn)定性、抑制氧化應(yīng)激等方式在正常細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用并抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；另一方面，自噬能為癌細(xì)胞提供能量、能促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)缺氧以及氧化應(yīng)激等的適應(yīng)、能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲等[9]。目前對(duì)于自噬與NSCLC 之間聯(lián)系已經(jīng)有了較多的研究進(jìn)展，但是針對(duì)NSCLC組織中CALCR的表達(dá)情況與細(xì)胞自噬相關(guān)性的研究依舊很少，故本實(shí)驗(yàn)基于此做了進(jìn)一步的探索，以對(duì)NSCLC與CALCR 的研究提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

酶標(biāo)儀（成都錦世昌祥科技有限公司，中國(guó)），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)），電泳儀和凝膠成像儀（BIO RAD，美國(guó)），臺(tái)式高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó)），超純水裝置（四川優(yōu)普超純科技有限公司，中國(guó)），高通量快速勻漿器（MP Biomedicals，美國(guó)）。

1.2 試劑

BCA 蛋白試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)），蛋白電泳上樣緩沖液5×（康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)），彩色預(yù)染蛋白（安徽欣伯玉生物科技有限公司，中國(guó)），GAPDH 一抗、Beclin-1 一抗、ATG5 一抗及ATG13 一抗（Proteintech，美國(guó)），CNR2 一抗及CNR1 一抗（Affinit，美國(guó)），P53 一抗（上海泊灣生物科技有限公司，中國(guó)），鼠抗兔IgG 二抗，羊抗鼠IgG 二抗（上海泊灣生物科技有限公司，中國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 研究對(duì)象

2021 年9 月到2022 年1 月共收集成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院20 對(duì)原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌肺組織樣本。

所有患者均未進(jìn)行手術(shù)治療并對(duì)患者的臨床病歷資料（年齡、性別、病理結(jié)果、分期、家族史、吸煙情況、腫瘤部位及腫瘤直徑等）進(jìn)行收集（見表1），其中男性6 例，女性14 例，年齡39-85 歲，TNM 分期為I-II 期。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，并獲得了核工業(yè)四一六醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理批準(zhǔn)。

表1 患者的臨床資料

1.3.2 Western blot

將保存于-80℃冰箱的組織加入RIPA 裂解液通過勻漿儀研磨，研磨后的組織勻漿利用離心機(jī)以12 g 離心20 min 取上清液。提取的上清液利用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度并對(duì)樣品濃度進(jìn)行適度調(diào)整，確定需要添加的SDS-PAGE Loading Buffer（Reducing，5×）（康為世紀(jì)公司）體積以及上樣體積。最后將樣品標(biāo)記好編號(hào)并金屬浴10 min，置于-20℃保存。制膠完成后，每孔加入等量蛋白，通過12% 濃度的聚丙烯酰胺凝膠開展電泳，待電泳完成后，開始利用PVDF 轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后利用5% BSA 室溫下封閉1 h 后，與相應(yīng)的一抗進(jìn)行孵育，包括抗P53抗體（1:1000），抗Beclin-1 抗體（1:1000），抗ATG5 抗體（1:1000），抗 ATG13 抗體（1:1000），抗 CALCR 抗體（1:1000），抗GAPDH 抗體（1:2000）。一抗孵育完成后，利用TBST 在常溫?fù)u床上清洗5 次，每次5 min。并利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000）室溫孵育2 h。最后將條帶均勻覆蓋發(fā)光液后通過凝膠成像儀曝光查看結(jié)果。利用Image-J計(jì)算條帶灰度值，并以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算目的蛋白與GAPDH 灰度比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析對(duì)CALCR 與ATG5、ATG13、Beclin-1 及P53 蛋白之間進(jìn)行相關(guān)性分析。運(yùn)用Graphad 軟件描繪柱狀圖。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組中CALCR 蛋白表達(dá)情況

如圖1 所示，與正常組（癌旁組織）比較，NSCLC 組中的CALCR 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.001）。

圖1 Western blot 測(cè)定NSCLC 癌組織及癌旁組織中CALCR 蛋白的表達(dá)情況

2.2 NSCLC 組CALCR 水平與臨床特征參數(shù)之間的關(guān)系

如圖2 所示，在NSCLC 組織中，CALCR 蛋白水平在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小等臨床特征參數(shù)上未見組間顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 分析CALCR 蛋白在不同病理特征的表達(dá)情況

2.3 NSCLC 組中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

如圖3 所示，與正常組（癌旁組織）比較，NSCLC 組中ATG5，ATG13，p53 及Beclin-1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖3 Western blot 測(cè)定NSCLC 癌組織及癌旁組織中ATG5、ATG13、Beclin-1 及p53 蛋白的表達(dá)情況

3 討論

CALCR 為降鈣素基因，是體內(nèi)最強(qiáng)的一種舒血管神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞，心血管及肺組織，并通過自分泌和旁分泌的方式作用于腫瘤細(xì)胞表面的肽類受體，在腫瘤的不同調(diào)控機(jī)制方面展現(xiàn)了較好的作用[10-12]。研究表明，CALCR 通過IL-2 增強(qiáng)細(xì)胞存活率，也可抑制NK 細(xì)胞的殺傷活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，總體刺激癌細(xì)胞分裂增殖[13,14]。同時(shí)，肺癌患者的血漿中CALCR 較正常人顯著升高，并隨肺癌浸潤(rùn)范圍和病情加重[15]。因此，CALCR 是腫瘤生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)CALCR 蛋白表達(dá)水平在NSCLC 組織中高表達(dá)，可能通過激活腺苷酸環(huán)化酶，通過升高cGMP 從而松弛平滑肌，導(dǎo)致血管擴(kuò)張，且血流加快，促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。同時(shí)，本研究的臨床病理因素分析顯示，CALCR 蛋白與患者年齡，性別，腫瘤直徑大小及腫瘤部位無相關(guān)性。且TNM 分期中未觀察到表達(dá)上差異性，可能是由于臨床樣本數(shù)量有限導(dǎo)致差異性不明顯。

自噬在腫瘤進(jìn)程中頻繁發(fā)生。在腫瘤初期，基礎(chǔ)水平的自噬通過降解細(xì)胞中受損成分或蛋白質(zhì)從而抑制腫瘤的發(fā)生。而在腫瘤晚期，自噬通過維持腫瘤細(xì)胞的基本代謝功能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，存活及惡性腫瘤的發(fā)生[17]。比如增強(qiáng)腫瘤的應(yīng)激耐受性和提供營(yíng)養(yǎng)來滿足細(xì)胞的代謝需求，從而促使腫瘤細(xì)胞即使在不良的環(huán)境下也能維持細(xì)胞存活。因此，自噬對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到正負(fù)雙向調(diào)控功能。本研究中，下調(diào)的自噬蛋白提示在NSCLC 中已不能維持基本水平的自噬，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究使用TNM分期為I-II期的患者標(biāo)本，主要傾向于腫瘤早期，這與使用的臨床樣品相吻合。由于腫瘤抑制基因p53 在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用：一方面，細(xì)胞核內(nèi)的p53 通過發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子潛能從而促進(jìn)自噬發(fā)生；另一方面，胞漿內(nèi)的p53通過抑制AMPK 活性從而抑制自噬[18]。本研究中，發(fā)現(xiàn)P53 蛋白和自噬相關(guān)蛋白均下調(diào)，表明P53 可能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子潛能從而誘導(dǎo)自噬。自噬體的形成與ATG 系列基因有關(guān)，如ATG5 是一種自噬相關(guān)基因，通過與ATG12形成ATG5-ATG復(fù)合體，參與自噬體膜的形成與延伸[19]。ATG13 是腫瘤抑制器和細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器，可影響能量消耗刺激自噬[20]。Beclin-1 是酵母ATG6 的同系物，其是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，主要與III 型PI3K 形成復(fù)合物來促進(jìn)其它的ATG蛋白如ATG5和ATG13在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，從而調(diào)節(jié)自噬活性[21]。研究表明Beclin-1 的低表達(dá)促進(jìn)肺癌，結(jié)腸癌，卵巢癌等進(jìn)程，此過程可能與促進(jìn)凋亡有關(guān)。Beclin-1 過表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，血管生成，促進(jìn)凋亡等[22]。因此，Beclin1、ATG5 和ATG13在自噬體的定位，自噬囊泡的形成和擴(kuò)展中起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 中Beclin-1、ATG5 及ATG13 蛋白下調(diào)，表明以上蛋白在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用，提示自噬活性在NSCLC 中降低，自噬體形成減少，自噬發(fā)生強(qiáng)度減弱。同時(shí)在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)CALCR 蛋白表達(dá)水平與ATG5蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性，而CALCR 蛋白表達(dá)水平與ATG13、P53、Beclin-1 蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，推測(cè)促癌基因CALCR 與抑癌基因p53 協(xié)同抑癌，導(dǎo)致細(xì)胞自噬能力降低，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性下降。CALCR 與ATG13 及Beclin-1 蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，與ATG5 蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性，提示CALCR 抑制可促進(jìn)自噬囊泡的形成及定位，但對(duì)自噬囊泡的延伸無影響。此過程可能是由于 CALCR 作為降鈣素基因，可激活PI3K/Akt/mTOR 通路，從而抑制 ATG13 及Beclin-1 的表達(dá)[23,24]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，CALCR 和自噬相關(guān)蛋白參與了NSCLC 的病理進(jìn)程，兩者指標(biāo)可協(xié)同作為診斷NSCLC 的有效標(biāo)志物，可稱為疾病治療的靶標(biāo)。