于嬪，朱蔚遠(yuǎn)

(邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 邵陽(yáng)，422001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是臨床上常見的消化系統(tǒng)急癥，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率為23.33～48.81/10萬[1]，且呈逐年上升趨勢(shì)。AP的主要病因包括膽石癥、過度飲酒、高脂血癥等。近年來，隨著人們生活水平的改善和飲食習(xí)慣的變化，我國(guó)高脂血癥性AP(hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP)的發(fā)病率不斷升高，已超過酒精性AP，成為僅次于膽源性AP的第二大AP[2]。與其他病因所致的AP相比，HLAP進(jìn)展快、并發(fā)癥多、病死率高、且易反復(fù)發(fā)作[3-4]。目前,針對(duì)HLAP早期臨床診斷的血清學(xué)檢查仍以傳統(tǒng)的血清淀粉酶為主，而高脂血癥往往會(huì)干擾血清淀粉酶的檢測(cè)結(jié)果[5]，導(dǎo)致漏診，延誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此，尋找新的、準(zhǔn)確的、獨(dú)立的HLAP早期診斷指標(biāo)，具有重大的臨床和社會(huì)意義。

微RNA(micro RNAs， miRNAs)是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA[6]，它是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可以與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)位點(diǎn)特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解mRNA，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的多種病理生理過程[7]。近年有多項(xiàng)研究表明，miRNAs與AP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]，但有關(guān)miRNAs和HLAP的研究尚罕見報(bào)道。本研究就HLAP患者外周血標(biāo)本中miR-122的表達(dá)量與其病情嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行初步探究，以期為HLAP患者的臨床診斷和病情評(píng)估提供新的思路和靶標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合我國(guó)AP診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；(2)血清三酰甘油≥11.3 mmol/L或血清在5.65～11.3 mmol/L之間呈乳糜狀；(3)發(fā)病24 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性炎癥性疾病患者；(2)惡性腫瘤患者；(3)精神疾病患者；(4)妊娠期患者；(5)合并放棄治療、轉(zhuǎn)院或死亡的患者。選取2020年1月至2021年12月期間邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的70例HLAP患者作為研究對(duì)象，并在入院后24 h內(nèi)完成APACHE Ⅱ評(píng)分及MCTSI評(píng)分[11]。根據(jù)MCTSI評(píng)分對(duì)HLAP患者進(jìn)行分組，6分以下為輕中度組(A組，n=39)，7～10分為重度組(B組，n=31)。另選取邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心同期30例高脂血癥而非AP患者(C組)和30例健康體檢者(D組)作為對(duì)照。本研究通過邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

RNA提取試劑NucleoZOL購(gòu)自德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司；異丙醇、無水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(編號(hào)：638315)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(編號(hào)：RR820A)及相關(guān)引物均購(gòu)自日本Takara公司；低溫高度離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份公司。NanoDrop One超微量核酸蛋白測(cè)定儀、梯度PCR儀、QuantStudio TM 5全功能定量PCR儀均購(gòu)自塞默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2.2 外周血miR-122檢測(cè)

(1)所有受試者入院后立即采集外周靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min后得到血清樣本，通過NucleoZOL試劑盒提取血清總RNA，并檢測(cè)RNA濃度、純度及完整度，置于-80 ℃冰箱保存待用。(2)通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)血清RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣本，置于-20 ℃冰箱保存待用。(3)取cDNA樣本，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-122的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒說明書設(shè)置。以U6作為內(nèi)參(引物序列詳見表1)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料比較

4組受試者性別、年齡、BMI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 4組受試者一般資料比較

2.2 受試者血清miR-122、三酰甘油、淀粉酶以及APACHE Ⅱ評(píng)分比較

A、B組患者血清miR-122表達(dá)明顯高于C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，B組患者血清miR-122的表達(dá)明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而C、D組之間miR-122的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 4組受試者血清miR-122、三酰甘油、淀粉酶以及APACHE Ⅱ評(píng)分比較

2.3 ROC曲線分析miR-122對(duì)HLAP的診斷價(jià)值

miR-122預(yù)測(cè)HLAP的曲線下面積(AUC)為0.849(P<0.001)，靈敏度為0.871，特異度為0.633，見圖1。

圖1 ROC曲線分析miR-122對(duì)HLAP的診斷價(jià)值Fig.1 ROC curve analyzed the diagnostic value of miR-122

2.4 HLAP患者血清miR-122表達(dá)水平與血清三酰甘油、淀粉酶、及APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性

HLAP患者血清miR-122表達(dá)水平與血清三酰甘油呈明顯正相關(guān)(r=0.794，P<0.001)，與APACHE Ⅱ評(píng)分呈明顯正相關(guān)(r=0.717，P<0.001)，與血清淀粉酶無明顯相關(guān)性(r=0.075，P=0.537)。

3 討論

1952年，KLATSKIN等[12]首次提出高脂血癥與AP存在關(guān)聯(lián)。隨著研究的深入，高脂血癥已經(jīng)被公認(rèn)為AP最主要的病因之一。相較于其他類型的AP，HLAP患者的發(fā)病年齡較低，起病急，常易進(jìn)展為重癥AP，預(yù)后欠佳[13]。HLAP的臨床表現(xiàn)并無特異性，仍以腹痛、腹脹為主，臨床實(shí)踐中常需與其他各類急腹癥相鑒別。而有研究表明，59.62%的HLAP患者血清淀粉酶并沒有明顯的升高，常引起漏診、誤診，給廣大臨床醫(yī)師尤其是缺乏進(jìn)一步檢查手段的基層醫(yī)師造成極大困擾[14]。因此，尋找更為精準(zhǔn)易行的HLAP診斷新指標(biāo)，是廣大臨床醫(yī)師的共同期望。

miR-122定位于人類18號(hào)染色體18q21.31，最早于2002年被發(fā)現(xiàn)[15]。多項(xiàng)研究表明，miR-122在脂質(zhì)代謝過程中起重要調(diào)控作用[16-18]。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在AP大鼠腸系膜淋巴液中miR-122表達(dá)明顯升高，且與AP嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19]。以上研究提示,miR-122與HLAP的發(fā)生發(fā)展可能存在一定關(guān)聯(lián)，但相應(yīng)的臨床研究尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，HLAP患者血清miR-122的表達(dá)量明顯高于高脂血癥組和健康對(duì)照組，并且其中重度組明顯高于輕度組，提示HLAP患者血清miR-122存在高表達(dá)，并與病情的嚴(yán)重程度存在一定關(guān)聯(lián)；而高脂血癥組和健康對(duì)照組相比無明顯差別，提示單純的高脂血癥并不會(huì)引起miR-122表達(dá)的升高。其次，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-122診斷HLAP的AUC為0.849，靈敏度為0.871，特異度為0.633，提示miR-122對(duì)HLAP具有良好的診斷效能。

APACHE Ⅱ評(píng)分是目前評(píng)估HLAP患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的常用指標(biāo)[20]。本研究通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，miR-122在HLAP患者外周血中的表達(dá)與APACHE Ⅱ評(píng)分存在明顯相關(guān)性，進(jìn)一步提示miR-122可以預(yù)測(cè)HLAP的嚴(yán)重程度。同時(shí)，miR-122在HLAP患者外周血中的表達(dá)與三酰甘油存在明顯相關(guān)性，而與淀粉酶無明顯相關(guān)性，提示miR-122可能通過參與脂質(zhì)代謝影響HLAP的進(jìn)展，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，HLAP患者血清miR-122呈高表達(dá)，且與病情嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)，提示miR-122具有成為HLAP臨床診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估的新型血清學(xué)指標(biāo)的潛力，亦可能成為HLAP基因治療的潛在靶點(diǎn)。囿于研究條件和病源數(shù)量的限制，納入的受試者人數(shù)有限，要進(jìn)一步論證miR-122的診斷和評(píng)估效能，仍需進(jìn)行多中心、大樣本的研究。