王濤，張偉，杜書祥，晉新峰，張雪濤，吳剛，孫培春

胃癌(gastric cancer,GC)是世界上第五大常見癌癥，也是每年導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。胃癌有多種組織學(xué)類型，具有不同的生物學(xué)特征。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)在2014年提出了胃癌的4種分子亞型：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)陽性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)、基因組穩(wěn)定型(GS)和染色體不穩(wěn)定型(CIN)[2]。EBVaGC(EB病毒相關(guān)性胃癌)由感染EBV的單克隆腫瘤細(xì)胞組成，占胃癌的5%～10%[3]，EBV陽性型的分子特征表現(xiàn)為周期性的PIK3CA基因突變、極度DNA甲基化，和JAK2、CD274(又稱PD-L1)與PDCDILG2(又稱PD-L2)基因擴(kuò)增。Derks等[4]的研究表明約15%的EBV(+)胃癌具有染色體9p24.1區(qū)域的基因組擴(kuò)增，這是編碼PD-1配體(PD-L1和PD-L2)的基因位點(diǎn)，故EBVaGC更容易出現(xiàn)PD-L1高表達(dá)。PD-L1是程序性細(xì)胞死亡受體1(PD-1)的配體，兩者結(jié)合可抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活，促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷[5]，而PD-1/PD-L1抑制劑可阻斷兩者結(jié)合，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)[6-8]。PD-L1在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，因此PD-L1作為免疫抑制檢查點(diǎn)已被廣泛研究[9-10]，PD-1抑制劑現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于PD-L1(+)腫瘤中[11-13]，并取得良好效果。

多項(xiàng)研究表明，腫瘤細(xì)胞或腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞(TIICs)上表達(dá)PD-L1是胃癌的預(yù)后因素，但PD-L1在EBVaGC中表達(dá)的意義尚未明確[14-15],因此我們探討胃癌中EBV與PD-L1之間的關(guān)系，不僅可以更好地理解EBVaGC的臨床病理特征，而且也可為EBVaGC的免疫治療提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年7月至2021年12月鄭州大學(xué)人民醫(yī)院收治的227例胃癌患者術(shù)后的癌組織為觀察組和30例癌旁組織作為對(duì)照組，并采用免疫組化(IHC)檢測(cè)其PD-L1的表達(dá)情況。227例胃癌患者中，男128例，女99例；年齡22～86歲，平均年齡60.50歲；227例胃癌組織中EBV(+)16例。腫瘤分期根據(jù)第8版UICC/AJCC TNM分期確定，其中Ⅰ～Ⅱ期134例，Ⅲ～Ⅳ期93例；根據(jù)腫瘤分化程度分為：腺癌181例，印戒細(xì)胞癌34例，鱗狀細(xì)胞癌8例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌4例；其中低分化123例，中-高分化104例；腫瘤浸潤深度：T1/T2 143例，T3/T4 84例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移93例；腫瘤位于賁門68例、胃體93例、胃竇66例；腫瘤直徑：≥5 cm 90例、≤5 cm 137例；存在脈管內(nèi)癌栓95例；神經(jīng)侵犯96例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床病理證實(shí)為胃癌且行胃癌根治術(shù)者；術(shù)前未行放化療者；臨床病理數(shù)據(jù)完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他惡性腫瘤者；臨床病理資料缺失者。

1.2 檢測(cè)方法與陽性判定

1.2.1 胃癌中PD-L1的檢測(cè)方法 試劑采用兔抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號(hào)22C3，丹麥DaKo公司)。采用免疫組化MaxVision法。將組織標(biāo)本切片，固定-脫水-透明-浸蠟后切成薄片(4～5 μm)備用，使用櫻花SAKURA Tissue-Tek染色機(jī)進(jìn)行HE染色；使用全自動(dòng)IHC染色儀對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行IHC染色，按照22C3 PharmDx試劑盒的操作流程進(jìn)行操作，然后對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染-封片-閱片。

PD-L1蛋白檢測(cè)均以人足月胎盤組織切片為陽性對(duì)照，以陰性質(zhì)控抗體代替一抗作為陰性對(duì)照。

我們采用聯(lián)合陽性評(píng)分(combined positive score，CPS)來評(píng)估胃癌組織的PD-L1的表達(dá)水平，CPS不僅評(píng)估腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平，同時(shí)也引入了淋巴細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，可以篩查出更多可能從免疫治療中獲益的患者，與TPS評(píng)分(tumor positive score)相比，CPS已成為一種更敏感的評(píng)分系統(tǒng)[16-18]。

1.2.2 胃癌中EBV的檢測(cè)方法 通過EBER ISH(原位雜交)，使用熒光標(biāo)記的EBER-1寡核苷酸探針檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中是否存在EBV。具體步驟：脫蠟水化-酶處理-EBER探針雜交-PBS沖洗-檢測(cè)和顯色，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)深棕色核染色判定EBV陽性。陽性對(duì)照為已知的EBER-1陽性的鼻咽癌組織；陰性對(duì)照為EBER-1的檢測(cè)探針。

1.2.3 PD-L1陽性判定 CPS計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)=(PD-L1陽性的腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總數(shù))/活的腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。當(dāng)CPS≥1時(shí)，判定PD-L1表達(dá)陽性[17]。CPS<1時(shí)，判定PD-L1表達(dá)陰性；1≤CPS<5判定為低表達(dá)；5≤CPS<10判定為中表達(dá)；CPS≥10判定為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，使用卡方檢驗(yàn)分析胃癌中PD-L1與EBV之間的關(guān)系及兩者與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中PD-L1的表達(dá)情況

227胃癌組織中PD-L1表達(dá)陽性92例，陽性率為40.53%(圖1A、1B)，30例癌旁組織中PD-L1表達(dá)陽性3例，陽性率為10.00%。故胃癌組織中PD-L1陽性率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.599；P=0.001)。

圖1 PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)(SP×400) 1A：PD-L1陽性表達(dá)(+);1B：PD-L1陰性表達(dá)(-)

2.2 胃癌組織中PD-L1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中PD-L1的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、浸潤深度、腫瘤位置、脈管內(nèi)癌栓均無相關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 EBV、PD-L1表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 胃癌中EB病毒與PD-L1表達(dá)的關(guān)系

227例胃癌組織標(biāo)本中EBV(+)的發(fā)生率為7.05%(16/227)(圖2A、2B)。在EBV(+)胃癌中，PD-L1陽性率為68.75%；在EBV(-)胃癌中，PD-L1陽性率為38.39%。我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中PD-L1表達(dá)與EBV(+)顯著相關(guān)(χ2=5.688；P=0.017)。

圖2 EBV在胃癌組織中的表達(dá)(SP×400) 2A：EBV陽性表達(dá)(+);2B：EBV陰性表達(dá)(-)

2.4 胃癌中EBV與臨床病理特征的關(guān)系

我們還分析了胃癌中EBV與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌中EBV與腫瘤位置(賁門)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯均無相關(guān)(P>0.05)(表1)。

2.5 PD-L1(+)胃癌中PD-L1的表達(dá)水平與EBV的關(guān)系

有趣的是，在PD-L1(+)胃癌中，EBV(+)胃癌CPS≥10有7例(63.64%)，而EBV(-)胃癌CPS≥10有20例(24.69%)，故與EBV(-)胃癌相比，PD-L1在EBV(+)胃癌中呈高表達(dá)(CPS≥10)(P<0.05)(表2)。

表2 PD-L1(+)胃癌中PD-L1的表達(dá)水平與EBV的關(guān)系[例(%)]

3 討論

PD-L1是B7共刺激分子家族的成員，它與PD-1結(jié)合后，PD-1胞質(zhì)區(qū)的TISM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，募集SHP-2磷酸酶，使Igα/β和Syk發(fā)生去磷酸化，從而傳遞抑制信號(hào)[19]，這種信號(hào)對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸和增殖。研究表明，胃癌組織中PD-L1的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且陽性率高達(dá)50%[20-22]。我們的結(jié)果表明，PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)為40.53%，與李毓飛、王岳君等[22-23]的研究結(jié)果一致。Wu等[24]研究表明胃癌組織中PD-L1的表達(dá)與腫瘤類型、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，而我們的研究表明PD-L1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯顯著相關(guān)(P<0.05),表明腫瘤分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵犯的患者PD-L1的表達(dá)率越高，這也說明PD-L1在胃癌的進(jìn)展中起著重要作用。PD-L1能否預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，目前尚存爭議。Xu等[25]的一篇Meta分析對(duì)481例胃癌患者腫瘤組織進(jìn)行IHC分析發(fā)現(xiàn)，與PD-L1(-)患者相比，PD-L1(+)患者預(yù)示較差的OS(overall survival)，而B?ger等[26]研究表明PD-L1和PD-1共表達(dá)預(yù)示良好的預(yù)后，故胃癌中PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究探討。

多項(xiàng)研究表明50%以上EBVaGC患者的腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到PD-L1表達(dá)，且PD-L1陽性者較陰性者預(yù)后更差[27-28]。我們的研究表明PD-L1在EBV(+)胃癌中的陽性率為68.75%，高于其他研究結(jié)果，造成這種差異的原因可能是：納入的樣本較少，采用不同評(píng)分系統(tǒng)，抗體差異等。目前，胃癌中PD-L1表達(dá)與EBV(+)的關(guān)系尚存爭議，Yoshida等[29]研究認(rèn)為胃癌中PD-L1表達(dá)與EBV(+)之間無相關(guān)性，而我們的研究表明胃癌中PD-L1表達(dá)與EBV(+)密切相關(guān)(P<0.05)，這與Derks等[4]、Nakano等[30]、Gu等[31]研究結(jié)果一致。EBV(+)胃癌除了具有9p24.1的擴(kuò)增外，還具有豐富的IFN-γ免疫反應(yīng)特征，其腫瘤浸潤性T細(xì)胞(TIICs)釋放的IFN-γ可直接誘導(dǎo)腫瘤和免疫細(xì)胞表達(dá)PD-L1；EBV(+)胃癌可能還有誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的其他機(jī)制，如EBV(+)的經(jīng)典霍奇金淋巴瘤，由于EBV誘導(dǎo)的AP-1表達(dá)和JAK/STAT信號(hào)的激活，也會(huì)導(dǎo)致PD-L1表達(dá)水平增加[32]。這些研究表明EBV(+)胃癌具有多種誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的機(jī)制，并提示PD-1驅(qū)動(dòng)的免疫逃避可能在EBV(+)胃癌中發(fā)揮重要作用。近年來，PD-1/PD-L1抑制劑在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌的治療中取得良好效果[9]。2021 CSCO胃癌診療指南中，我國已經(jīng)將免疫治療地位提升至一線并覆蓋晚期胃癌全程治療中，因EBV(+)胃癌患者的腫瘤微環(huán)境中也存在免疫抑制。本研究已證實(shí)胃癌中PD-L1表達(dá)與EBV(+)顯著相關(guān)(P<0.05)，且PD-L1在EBV(+)胃癌中呈高表達(dá)(CPS≥10)，故EBV aGC患者可能也是PD-L1/PD-1抑制劑治療的受益人群。

我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)EBV(+)胃癌患者的腫瘤常位于賁門，且EBV(+)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，李淑英等[33]的研究也顯示EBV(+)胃癌多發(fā)生于胃上部，表明胃上部癌更易出現(xiàn)EBV感染，且EBV感染可能會(huì)促使腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移與浸潤，同時(shí)也預(yù)示不良的預(yù)后。故早期檢測(cè)EBV(+)胃癌中PD-L1的表達(dá)情況對(duì)EBV(+)胃癌的免疫治療有一定指導(dǎo)意義。