王森，劉萱，王天路，黃保勝，文立利，張雅旋，曹博強(qiáng), 徐笑，張寅

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占所有顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的30%～40%，其具有起病隱匿、惡性程度高等特點，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已達(dá)疾病晚期[1-2]。因此，臨床上急需尋找可用于早期診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤并能有效評估預(yù)后的分子靶標(biāo)，以改善患者的預(yù)后。微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance，MCM)家族是廣泛存在于真核生物的一類高度保守的蛋白質(zhì)，于20世紀(jì)80年代在篩選釀酒酵母菌突變體的研究中被首次發(fā)現(xiàn)并命名，迄今為止，研究人員共發(fā)現(xiàn)10個MCM家族成員，它們之間具有高度同源性[3-4]。目前研究結(jié)果表明，在MCM家族的8個成員中，有7個成員(MCM2～7及MCM10)主要參與真核生物體DNA復(fù)制過程，MCM10在膠質(zhì)瘤中具有不同程度的表達(dá)，參與腦細(xì)胞增殖等生理過程，但其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響目前鮮見報道[5-6]。本研究選取神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者60例，通過檢測其腫瘤組織中的MCM10表達(dá)情況，旨在探討MCM10對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床特征及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2013年12月至2017年3月收治的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者60例，其中男34例，女26例；年齡11～74歲，平均(43.82±8.73)歲。首發(fā)癥狀：頭痛21例，肌力降低15例，頭暈11例，嘔吐11例，另有8例患者伴面部感覺運(yùn)動障礙、肢體感覺異常及癲癇等癥狀。入組患者術(shù)前Karnofsky(KPS)評分30～90分，中位數(shù)為65分。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)(審批號:2016年科研第22號)，所有患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前評估及治療方法 術(shù)前用磁共振成像(MRI)掃描患者頭顱，根據(jù)腫瘤位置、大小分別選擇經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室前角、經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室后角、經(jīng)皮質(zhì)側(cè)腦室三角區(qū)及經(jīng)胼胝體-蒼穹間入路行手術(shù)切除，術(shù)中常規(guī)留取腫瘤組織行病理學(xué)檢查。術(shù)后7 d復(fù)查所有患者頭顱MRI，以此判斷腫瘤切除程度。具體評價標(biāo)準(zhǔn)如下，①完全切除：未見腫瘤殘留；②近全切除：可見腫瘤部分殘留，殘留體積<切除前的10%；③部分切除：可見腫瘤殘留，殘留體積≥切除前的10%。術(shù)后13例行單純放療，8例行單純化療，29例行放療聯(lián)合化療，10例未采取任何輔助治療措施。

1.2.2 腫瘤病理學(xué)檢查及WHO分級 術(shù)后對腫瘤組織行病理學(xué)檢查，按世界衛(wèi)生組織(WHO)分類將其分為4級(Ⅰ～Ⅳ級)，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別，Ⅲ～Ⅳ級為高級別。本組60例患者中WHO Ⅰ級10例，Ⅱ級21例，Ⅲ級16例，Ⅳ級13例。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測MCM10表達(dá)情況

將術(shù)中取得的腫瘤組織標(biāo)本行石蠟包埋，選取腫瘤組織豐富的3張切片，采用鏈霉素親和素-過氧化物酶偶聯(lián)法染色，以MCM10多克隆抗體(1∶500，美國Alcam公司)作為一抗，生物素化山羊抗家兔IgG(1∶50，美國Alcam公司)作為二抗。染色成功后，采用顯微鏡成像系統(tǒng)(德國ZEISS公司)掃描，應(yīng)用Image J軟件對切片陽性率及染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞核為棕褐色或棕黃色表示組織中MCM10表達(dá)陽性，陽性率>75%記4分，50%<陽性率≤75%記3分，25%<陽性率≤50%記2分，陽性率≤25%記1分；細(xì)胞核為棕褐色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，未著色記0分；②將染色強(qiáng)度評分與陽性率的乘積作為免疫組織化學(xué)得分的最終得分，9～12分為強(qiáng)陽性，4～8分為陽性，1～3分為弱陽性，0分為陰性；③MCM10表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：乘積得分≥6分為高表達(dá)，乘積得分<6分為低表達(dá)[7]。

1.3 術(shù)后隨訪

出院后采用門診或電話的方式對患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止到2020年12月，達(dá)隨訪終點或患者死亡定義為隨訪結(jié)束。隨訪內(nèi)容包括：術(shù)后間隔3個月復(fù)查頭顱MRI(平掃+增強(qiáng))，以評價腫瘤復(fù)發(fā)情況；術(shù)后3個月復(fù)查KPS評分，以評價癥狀改善情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者手術(shù)及隨訪結(jié)果

60例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后7 d復(fù)查頭顱MRI結(jié)果顯示，腫瘤完全切除21例(35.00%)，近全切除37例(61.67%)，部分切除2例(3.33%)。60例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者隨訪0.3～36.0個月，中位時間22.9個月；KPS評分0～100分，中位數(shù)65分；其中22例(36.67%)改善，10例(16.67%)無明顯變化，28例(46.67%)評分降低。到隨訪期結(jié)束，35例存活，其中10例復(fù)發(fā)，行二次手術(shù)治療；25例死亡，其中16例死于神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)，6例死于術(shù)后并發(fā)癥，3例死因不明。

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)情況

60例患者腫瘤組織中均檢測到不同程度的MCM10蛋白表達(dá)，依據(jù)免疫組織化學(xué)得分，29例為低表達(dá)，31例為高表達(dá)。WHO分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)得分分別為(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.508，P<0.05)。兩兩比較顯示，WHO Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)明顯高于WHO Ⅰ級患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，WHO Ⅳ級患者M(jìn)CM10蛋白表達(dá)水平明顯高于WHO Ⅱ級患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他分級之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床資料比較

MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組患者的年齡、性別、術(shù)前KPS評分、WHO分級、術(shù)后輔助治療及術(shù)后復(fù)發(fā)比例等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床資料比較

2.4 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線比較

MCM10蛋白高表達(dá)組患者的生存時間明顯低于MCM10蛋白低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=4.250，P<0.05)。至隨訪期末，共26例患者復(fù)發(fā)，生存曲線分析結(jié)果顯示，在復(fù)發(fā)的患者中，MCM10蛋白高表達(dá)組患者的生存時間明顯短于MCM10蛋白低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=3.535，P<0.05)，見圖1、圖2。

圖1 MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

圖2 復(fù)發(fā)患者中MCM10蛋白低表達(dá)組與高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

2.5 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級、術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤切除程度及MCM10蛋白表達(dá)水平是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。進(jìn)一步將上述指標(biāo)納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級高、術(shù)后復(fù)發(fā)及MCM10蛋白表達(dá)水平高是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科的常見疾病之一，可發(fā)生于任何年齡，以40～60歲多見，文獻(xiàn)報道該病的男女患病比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義[8-9]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)多種多樣，早期缺乏特異性癥狀，患者病程可為數(shù)周至數(shù)年，呈進(jìn)行性發(fā)展。常見的臨床表現(xiàn)包括頭痛、精神癥狀、局灶性運(yùn)動功能損害、抽搐及震顫等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床表現(xiàn)的不確定性與腫瘤的彌漫性生長破壞了大腦皮層之間以及大腦皮層與其下級中樞的聯(lián)系有關(guān)，早期診斷較困難[10-12]。近年來，隨著臨床診斷學(xué)的發(fā)展以及實驗技術(shù)水平的提高，臨床醫(yī)師們致力于尋找有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷及預(yù)后評價的指標(biāo)，以期改善患者預(yù)后。

MCM蛋白質(zhì)家族是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)。早期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MCM蛋白的異常表達(dá)尤其是過表達(dá)，在諸多人類癌前病變及癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，如結(jié)腸癌、前列腺癌、腦膜瘤、胃腺癌、骨肉瘤及乳腺癌等[13]。MCM蛋白家族成員異常表達(dá)已成為多種惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。其中，MCM2是腎細(xì)胞癌、少突膠質(zhì)細(xì)胞、乳腺癌、喉癌、卵巢癌、口腔癌等的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM3是甲狀腺乳頭狀癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM4是非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM5是前列腺癌和卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM6是原發(fā)性肝癌的生物學(xué)標(biāo)志物，MCM7是小細(xì)胞肺腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌的生物學(xué)標(biāo)志物[14-17]。MCM10是近年來新發(fā)現(xiàn)的MCM蛋白質(zhì)家族成員，研究表明，MCM10在宮頸癌發(fā)生發(fā)展不同階段的表達(dá)水平均高于周圍正常組織[18-19]。Weller等[20]采用RT-PCR及微陣列計數(shù)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的MCM10表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，證實在WHO病理分級Ⅲ～Ⅳ級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中，MCM10表達(dá)水平隨病理分級的增加而增加。本研究結(jié)果顯示，WHO分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級患者M(jìn)CM10表達(dá)得分分別為(3.71±1.20)分、(5.84±2.26)分、(7.53±3.51)分、(7.89±2.82)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MCM10蛋白低表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時間明顯長于MCM10蛋白高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在26例復(fù)發(fā)患者中，MCM10蛋白低表達(dá)組的生存時間明顯長于MCM10蛋白高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明在預(yù)后差及復(fù)發(fā)患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中,MCM10蛋白表達(dá)水平明顯增高。Cox回歸分析篩選神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素結(jié)果顯示，腫瘤WHO分級高、術(shù)后復(fù)發(fā)及MCM10蛋白高表達(dá)是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存的獨立危險因素。提示MCM10可作為評判神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)之一。

綜上所述，神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中均有不同程度的MCM10表達(dá)，其表達(dá)水平在WHO Ⅰ～Ⅳ級患者中逐漸增加。MCM10高表達(dá)患者的生存期較短，且術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)，臨床上可將腫瘤組織MCM10表達(dá)水平作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后評價的指標(biāo)。