陳露，馬良，譚紅霞，朱文優(yōu)，曾鵬，尹禮國*

(1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.宜賓學院 農(nóng)林與食品工程學部，四川 宜賓 644000；3.西南大學 食品科學學院，重慶 400715)

泡菜是利用有益微生物對新鮮蔬菜進行加工而制得的一種發(fā)酵蔬菜。在泡菜發(fā)酵過程中，由于原輔料、發(fā)酵方式、地域環(huán)境等存在差異，被分為榨菜、泡菜、醬菜等不同種類[1-2]。我國泡菜發(fā)展歷史悠久，其中，極具代表性的是四川泡菜。據(jù)報道，四川泡菜年產(chǎn)量約占我國泡菜年產(chǎn)總量的70%[3]。四川泡菜主要以新鮮蔬菜或特殊的動物肉類為原料，選擇性添加生姜、大蒜、辣椒等輔料，然后經(jīng)食鹽水泡漬發(fā)酵加工而成[4-5]。泡菜中富含維生素、膳食纖維、有機酸、益生菌、氨基酸等多種有益成分[6]。此外，泡菜還具有多種功能活性。相關研究表明，泡菜具有抗動脈硬化、抗氧化、降血壓、抗衰老、降膽固醇、抗過敏、抗癌等多種功效[7-9]。

近年來，隨著泡菜加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其生產(chǎn)規(guī)模已由家庭作坊式小型化生產(chǎn)發(fā)展為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。加之其風味獨特、口感脆嫩清香，已成為主要的調(diào)味料或下飯菜，并越來越受歡迎[10]。然而，傳統(tǒng)自然發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化泡菜常出現(xiàn)生物胺等有毒有害物質(zhì)污染的問題。生物胺是一組具有生物活性的低分子量堿性含氮有機化合物，主要包括組胺、酪胺、腐胺和尸胺[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，若攝入過量生物胺，會引起偏頭痛、腹部痙攣、惡心、頭痛、嘔吐、皮疹、高血壓等不良反應和疾病。在非常嚴重的情況下，會引起心慌、腦出血甚至是死亡[13]。當存在亞硝酸鹽時，生物胺可以充當致癌的N-亞硝胺的前體，從而誘導具有致癌性的亞硝胺的形成，對人體造成毒害作用[14]。

目前，關于泡菜食品中亞硝酸鹽的報道較多，而對于生物胺的研究相對較少[15]。蔬菜發(fā)酵離不開微生物的作用，而在此過程中，一些微生物能夠誘導氨基酸脫酸產(chǎn)生生物胺[16]。因此，發(fā)酵蔬菜會不可避免地受到生物胺的污染。本文以我國傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜為研究對象，主要研究不同發(fā)酵條件下泡菜中生物胺的污染情況，分析得出泡菜在不同發(fā)酵工藝(溫度、時間、鹽濃度)下生物胺的變化規(guī)律，旨在探尋泡菜中生物胺含量較低、品質(zhì)較好的工藝條件，以提高泡菜食品的安全性。同時，為泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中生物胺含量變化規(guī)律的研究和品質(zhì)調(diào)控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的白蘿卜(無明顯損傷和病蟲害)、食鹽、白砂糖、干辣椒：皆購自宜賓市翠屏區(qū)蓉戎超市；腐胺(putrescine，Put，純度≥98%)、尸胺(cadaverine，Cad，純度≥98%)、組胺(histamine，Him，純度≥98%)、酪胺(tyramine，Tym，純度≥98%)等標準品：美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸、氫氧化鈉、高氯酸、碳酸氫鈉、氨水(均為分析純)：成都市科龍化工試劑廠；丹磺酰氯標準品(純度>99%)：上海麥克林生化科技有限公司；超純水：美國Millipore公司；乙腈(色譜純，純度≥98%)、甲醇(色譜純，純度≥98%)：美國Honeywell公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀、反相HPLC色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) 美國ThermoFisher Scientific公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；KQ-50超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；QL-901 Vortex旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；NK200-1B可視氮吹儀 常州朗越儀器制造有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海圣科儀器設備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 上海新諾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同發(fā)酵時間下泡菜的制作方法

將新鮮白蘿卜清洗干凈，晾干，然后切成長、寬、高分別為4，3，2 cm的塊狀，裝入5 L的泡菜壇中，再分別加入一定量洗凈并晾干的干辣椒(3%，以蘿卜質(zhì)量計)和白砂糖(3%，以蘿卜質(zhì)量計)，并將壇中的材料壓緊；然后向泡菜壇中加入食鹽水(冷開水配制)，加至壇沿處，菜和鹽水的質(zhì)量比為1∶2，控制鹽濃度為鹽水總質(zhì)量的4%。保證食鹽水淹沒蔬菜，控制鹽水離壇口3～5 cm的距離。然后將壇沿加水密封，隨后置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別于第1，3，5，7，9，11，13，15天測定泡菜中生物胺含量。

1.3.2 不同發(fā)酵溫度下泡菜的制作方法

將新鮮白蘿卜清洗干凈，晾干，然后切成長、寬、高分別為4，3，2 cm的塊狀，裝入5 L的泡菜壇(準備4組，從A～D編號，每組3個平行)中，再分別加入一定量洗凈并晾干的干辣椒(3%，以蘿卜質(zhì)量計)和白砂糖(3%，以蘿卜質(zhì)量計)，并將壇中的材料壓緊；然后向泡菜壇中加入食鹽水(冷開水配制)，加至壇沿處，菜和鹽水的質(zhì)量比為1∶2，控制鹽濃度為鹽水總質(zhì)量的4%。保證食鹽水淹沒蔬菜，控制鹽水離壇口3～5 cm的距離。然后將壇沿加水密封，隨后分別置于20，25，30，35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。待發(fā)酵時間為15 d時，分別對不同發(fā)酵溫度下泡菜樣品中生物胺含量進行測定。

1.3.3 不同發(fā)酵鹽濃度下泡菜的制作方法

將新鮮白蘿卜清洗干凈，晾干，然后切成長、寬、高分別為4，3，2 cm的塊狀，裝入5 L的泡菜壇(準備4組，從A～D編號，每組3個平行)中，再分別加入一定量洗凈并晾干的干辣椒(3%，以蘿卜質(zhì)量計)和白砂糖(3%，以蘿卜質(zhì)量計)，并將壇中的材料壓緊；然后向泡菜壇中加入食鹽水(冷開水配制)，加至壇沿處，菜和鹽水的質(zhì)量比為1∶2，分別控制1～4號泡菜壇中鹽濃度分別為鹽水總質(zhì)量的2%、4%、6%和8%，保證食鹽水淹沒蔬菜，控制鹽水離壇口3～5 cm的距離。然后將壇沿加水密封，隨后將所有的泡菜壇置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。待發(fā)酵時間為15 d時，分別測定不同鹽濃度下發(fā)酵泡菜樣品中生物胺含量。

1.3.4 泡菜樣品前處理方法

樣品前處理參照Fong等[17]的方法并稍作修改，準確移取2.0 g分別在不同條件下發(fā)酵的泡菜樣品，用研缽研碎后，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入6 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，渦旋混勻5 min，超聲15 min。靜置后，在4 ℃下以 8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，向剩下的固體提取物中加入4 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，在4 ℃下以 10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，合并兩次提取液。

1.3.5 泡菜樣品衍生方法

樣品的衍生和檢測參照Fong等的方法并稍作修改。準確移取2 mL上述提取液至10 mL具塞試管中，依次加入200 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、600 μL飽和碳酸氫鈉溶液、4 mL 10 mg/mL丹磺酰氯衍生劑，然后蓋塞，在40 ℃下避光反應45 min。反應結束后加入200 μL氨水終止反應，靜置30 min，加入3 mL乙腈至總體積為10 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜測定。

1.3.6 標準溶液的配制

準確稱取腐胺、尸胺、組胺、酪胺標準品各0.0015 g(精確至0.0001 g)分別于1.5 mL棕色瓶中，用1.5 mL的HCl溶液(0.1 mol/L)溶解，混勻，配制成質(zhì)量濃度均為1.000 mg/mL的生物胺單標儲備液，在-20 ℃下避光保存。隨后將各單標儲備液用HCl溶液稀釋并配制成系列濃度的標準單標工作溶液。

1.3.7 高效液相色譜分析條件

色譜柱：反相HPLC色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：超純水；流動相B：乙腈；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：254 nm。洗脫程序見表1。

表1 生物胺樣品分離流動相梯度設置

1.3.8 生物胺線性實驗、檢測限及定量限分析方法

將生物胺混合使用液分別用0.1 mol/L的HCl溶液配制成0.001，0.01，1，5，25，50 μg/mL，經(jīng)衍生后(衍生方法與1.3.5相同)，用高效液相色譜法進行測定。以生物胺濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標作標準曲線，得線性方程。根據(jù)信噪比S/N≥3，得出檢測限；根據(jù)信噪比S/N≥10，得出定量限。

1.3.9 泡菜感官品質(zhì)分析方法

選擇10名具備食品專業(yè)背景的非本項目組成員，組成評定小組，分別從色澤、香味、滋味、質(zhì)地4個方面對不同發(fā)酵時間下的泡菜進行取樣和感官評價，各項滿分均為100分，具體見表2。

表2 感官評價表

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理，并將數(shù)據(jù)結果以平均值±標準偏差的形式表示。采用 Origin 2018、Adobe Photoshop CS5.1和IBM SPSS Statistics 20.0進行圖像繪制及數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 生物胺標準曲線繪制

本文選擇在0.001～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，對生物胺的峰面積與相應濃度進行線性回歸，得到腐胺的線性回歸方程y=3.8339x-0.1734(R2=0.9988)；尸胺的線性回歸方程y=3.3828x-0.0520(R2=0.9996)；組胺的線性回歸方程y=1.3161x-0.2168(R2=0.9996)；酪胺的線性回歸方程y=0.2130x-0.0644(R2=0.9982)。線性相關系數(shù)大于0.99，說明線性關系良好。根據(jù)1.3.8中檢測限和定量限的計算方法，得出腐胺、尸胺、組胺和酪胺的檢測限均為0.001 μg/mL；定量限均為0.003 μg/mL。生物胺標準曲線圖和液相色譜圖分別見圖1和圖2，泡菜樣品中生物胺液相色譜圖見圖3。

圖1 生物胺標準曲線

圖2 生物胺的高效液相色譜圖

圖3 泡菜樣品中生物胺的高效液相色譜圖

2.2 不同發(fā)酵時間下泡菜中生物胺動態(tài)變化情況

不同發(fā)酵時間下，泡菜中總生物胺含量動態(tài)變化情況見表3。

表3 不同發(fā)酵時間下泡菜中生物胺含量

由表3可知，在泡菜發(fā)酵過程中，腐胺和酪胺均呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢，且都在發(fā)酵第11天達到最高值，分別為(154.94±0.002) mg/kg和(56.04±0.039) mg/kg。組胺和尸胺則分別在第3天和第5天才檢測到，且隨著發(fā)酵時間的增加，它們的含量也逐漸增加，同樣在第11天達到最高值，分別為(59.17±0.006) mg/kg和(11.13±0.003) mg/kg，此后逐漸降低?？偵锇泛肯仍黾?，在第11天達最大值(281.28 mg/kg)，然后稍有降低。從研究結果來看，泡菜中腐胺的平均含量最高(97.16 mg/kg)，其次是組胺(38.71 mg/kg)和酪胺(37.86 mg/kg)，尸胺的平均含量相對較低(7.68 mg/kg)。對于同一天發(fā)酵的泡菜樣品，其腐胺的含量比其他3種生物胺的含量更高。腐胺含量更高的原因可能與泡菜發(fā)酵過程中生成鳥氨酸脫羧酶的微生物較為活躍有關。

在蘿卜泡菜自然發(fā)酵初期，好氧菌(如腸桿菌屬，Enterobacter)和酵母菌(Millerozymafarinosa)為優(yōu)勢菌群。在發(fā)酵中后期，乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)等[18-20]，這些微生物能夠促進氨基酸脫羧，生成相應的生物胺[21]。其中，鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸和酪氨酸可分別在相應氨基酸脫酸酶的作用下生成腐胺、尸胺、組胺和酪胺，且精氨酸脫羧酶和谷氨酸脫羧酶分別作用于精氨酸和谷氨酸后形成鳥氨酸[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌如陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、桑樹腸桿菌(Enterobactermori)、酵母菌以及費斯莫爾德乳桿菌(Lactobacillusversmoldensis)、凝乳酶乳桿菌(Lactobacillusrennin)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)等具有較強形成腐胺的能力。因此，泡菜樣品中高含量的腐胺可能與泡菜發(fā)酵過程中生成鳥氨酸脫羧酶的微生物較為活躍有關[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)和腸桿菌能夠分別作用于組氨酸脫酸酶和賴氨酸脫酸酶形成組胺和尸胺，而本研究中，在發(fā)酵第1天未檢出組胺，而在前3 d均未檢出尸胺，可能是由于能夠產(chǎn)生這兩種生物胺的相應微生物還未產(chǎn)生或產(chǎn)生數(shù)量較少[25-26]。 研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對酪胺的形成有一定促進作用，而本研究中發(fā)酵第9天檢測到酪胺的量比發(fā)酵第7天有了明顯增加，可能與乳酸菌大量生成有關[27]。

2.3 不同溫度下泡菜中生物胺含量變化情況

在不同溫度下，泡菜中腐胺、尸胺、組胺和酪胺以及總生物胺的含量見表4。

表4 不同發(fā)酵溫度下泡菜中生物胺含量

由表4可知，在發(fā)酵溫度為20 ℃時，泡菜中總生物胺含量最高(105.58 mg/kg)，25 ℃時總生物胺含量最低。

對于不同種類的生物胺，腐胺是檢出量最高的生物胺(最高檢出量為49.22 mg/kg)，泡菜中腐胺的含量相對其他生物胺較高，可能是由于在本文研究的溫度條件下，腐胺的前體物質(zhì)——精氨酸的形成量較多[28]。此外，腐胺的最高檢出量所在的溫度為35 ℃。本研究結果與Cvetkovic等[29]研究的白菜泡菜在不同發(fā)酵溫度下生物胺含量略有差異，他們研究發(fā)現(xiàn)腐胺是檢出量最高的生物胺，但其在20 ℃下含量最高(48.02 mg/kg)，這可能是發(fā)酵原料不同，導致不同溫度下泡菜發(fā)酵體系中菌群組成有差異，因而產(chǎn)胺能力不同。在所有溫度下，腐胺的含量在24.75～49.22 mg/kg的范圍內(nèi)，酪胺的含量介于21.01～30.38 mg/kg之間。組胺和酪胺的含量在20 ℃時最高，分別為32.78 mg/kg和30.38 mg/kg。蘿卜泡菜在35 ℃下發(fā)酵時生物胺含量較低，可能是由于該條件下溫度相對較高，腸桿菌科和假單胞菌等易產(chǎn)生生物胺的微生物的生長受到抑制[30]。

2.4 不同鹽濃度下泡菜中生物胺含量變化情況

不同鹽濃度下泡菜中腐胺、尸胺、組胺、酪胺以及總生物胺的含量見表5。

表5 不同鹽濃度下泡菜中生物胺含量

由表5可知，隨著鹽濃度的增加，總生物胺含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，說明高鹽濃度對生物胺有較好的抑制效果，尤其是當鹽濃度增加到6%時，總生物胺含量顯著降低(P<0.01)。已有研究表明，高鹽主要通過降低氨基酸脫羧酶的活性，從而阻礙生物胺前體物質(zhì)的生成[31]。

對于不同種類的生物胺，腐胺的總檢出量最高，為147.48 mg/kg，且其最高檢出量大于100 mg/kg，即將超過目前發(fā)酵蔬菜總生物胺的限量允許值(100～200 mg/kg)，因此存在較大風險。酪胺是檢出量最高的生物胺，在含鹽量為2%、4%和6%的情況下均有酪胺檢出，可能是由于具有酪氨酸脫酸酶活性的微生物能夠耐受較高濃度的鹽[32]。當鹽濃度為6%及以上時，未檢出組胺，說明以希氏乳桿菌為主的產(chǎn)胺微生物對鹽的耐受能力差[33]。當鹽濃度為4%及以上時，均未檢出尸胺，說明增大鹽濃度能夠很好地限制參與尸胺形成的微生物的表達能力[34]。

此外，相關研究發(fā)現(xiàn)，在鹽濃度較高的條件下，部分耐鹽菌能在一定程度上降解生物胺。Li等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽濃度為12%的條件下，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對尸胺、組胺和酪胺的降解率分別為33.44%、32.74%和39.93%。

2.5 感官評價結果與分析

在控制發(fā)酵溫度(25 ℃)和鹽濃度(4%)的條件下，采用打分法對不同發(fā)酵時間下泡菜樣品的色澤、香味、滋味、質(zhì)地等進行評分，具體評分結果見表6。

表6 不同發(fā)酵時間下泡菜感官評分

續(xù) 表

由表6可知，發(fā)酵第7天的泡菜總體感官評分最高。隨著發(fā)酵的進行，泡菜的汁液從清亮逐漸變得渾濁，泡菜質(zhì)地逐漸軟化，硬度和脆度降低，酸味逐漸變得明顯且不協(xié)調(diào)。但所有泡菜均無明顯的餿味、霉味等不良風味，也未出現(xiàn)明顯的苦味、澀味。尤其是發(fā)酵第7天的泡菜，其汁液仍然保持清亮，光澤度好且無肉眼可見的霉花浮膜現(xiàn)象，香味濃郁，滋味鮮美，具有泡蘿卜特有的清香味，酸味和咸味協(xié)調(diào)柔和，同時，泡菜形態(tài)大小均一，組織緊密，質(zhì)地較為脆嫩，未見明顯菜屑。

3 結論與討論

本文主要研究了不同發(fā)酵條件(包括發(fā)酵時間、溫度、鹽濃度)下，泡菜中生物胺以及泡菜感官品質(zhì)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的增加，泡菜中總生物胺的含量呈先逐漸升高后緩慢降低的趨勢。在發(fā)酵時間相同的情況下，腐胺含量比其他3種生物胺的含量更高，這與發(fā)酵泡菜中含有大量與腐胺形成相關的微生物有關。目前，雖未對泡菜中腐胺進行明確限量，但其含量已超過150 mg/kg。由于腐胺會引起咳嗽、喘息、喉炎、氣短、頭痛、惡心、嘔吐、低血壓等癥狀，嚴重的會造成死亡。同時，腐胺還能與其他物質(zhì)產(chǎn)生聯(lián)合毒性，如與尸胺聯(lián)合，會抑制腸道中二胺氧化酶和組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，并增強了組胺的毒性作用；與亞硝酸鹽形成致癌物亞硝胺，因此，應引起足夠重視。

對于不同溫度下發(fā)酵的泡菜樣品，目前的結果表明，在發(fā)酵溫度為20 ℃時泡菜中總生物胺含量最高，而在25 ℃時總生物胺含量相對較低。雖然在35 ℃時總生物胺含量與25 ℃時相近，但考慮到高溫條件下，泡菜質(zhì)地更易變軟，口感變差。因此，建議將發(fā)酵溫度控制在25 ℃，在此條件下，泡菜的感官品質(zhì)和安全性均較高。

對于不同鹽濃度下發(fā)酵的泡菜，隨著鹽濃度的增加，總生物胺含量逐漸降低，說明增加鹽濃度可在一定程度上抑制生物胺的積累。但由于高鹽與當今倡導的低鹽生活理念不符，而且高鹽易導致高血壓等一系列疾病[36]，因此，在低鹽發(fā)酵條件下，獲得低生物胺含量的泡菜是今后需要研究的方向之一。