劉曉，宋曉飛，鄭小剛

（1.南陽(yáng)市內(nèi)鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院 骨科，河南 南陽(yáng) 474300；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院 骨二科，河南 南陽(yáng) 473000）

骨性關(guān)節(jié)炎作為臨床常見(jiàn)骨科疾病，以關(guān)節(jié)軟骨變性、半月板及韌帶退變等為主要表現(xiàn)，屬于慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，對(duì)患者日?；顒?dòng)及生活質(zhì)量產(chǎn)生極大的消極影響［1-2］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未完全闡明其具體病理機(jī)制，且臨床主要依賴(lài)與臨床體征變化、影像學(xué)表現(xiàn)評(píng)估病情嚴(yán)重程度，缺乏客觀指標(biāo)，致使臨床預(yù)防及治療難度增加［3］。研究發(fā)現(xiàn)，活性因子在關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。S100 鈣結(jié)合蛋白B（S100 calciumbinding protein B,S100B）作為S100 鈣結(jié)合蛋白家族成員，參與影響細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程；軟骨破壞作為骨性關(guān)節(jié)炎主要病理改變，或與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)；Ⅱ型膠原羧基端端肽（Ctelopeptide of type Ⅱcollagen,CTX-Ⅱ）作為關(guān)節(jié)軟骨主要成分Ⅱ型膠原蛋白降解產(chǎn)物，其數(shù)值變化與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)［5-6］；而NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）作為多蛋白復(fù)合物，激活后可通過(guò)活化caspase-1 對(duì)白介素細(xì)胞等細(xì)胞因子生成、分泌產(chǎn)生誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)［7］。但臨床中對(duì)S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3在膝骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)情況尚不清晰，基于此，以上述內(nèi)容為背景，測(cè)定血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達(dá)水平，分析其在膝骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020 年9 月至2021 年9 月南陽(yáng)市內(nèi)鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院收治的79 例膝骨關(guān)節(jié)炎患者為研究組，其中男49例，女30 例；年齡45～61歲，平均（53.00±6.80）歲；按照Recht 標(biāo)準(zhǔn)［8］分為Ⅰ級(jí)25 例、Ⅱ級(jí)33 例、Ⅲ級(jí)21例。另選100 例同期體檢健康人員為對(duì)照組，其中男58例，女42例；年齡42～69 歲（55.50±11.48）歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）》中對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；年齡40～70 歲；存在關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)疼痛等表現(xiàn)；X 線檢查顯示關(guān)節(jié)緣見(jiàn)骨贅、關(guān)節(jié)間隙變窄；對(duì)照組人員無(wú)任何相關(guān)疾??；簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎功能不全；存在糖尿病、高血壓等其他內(nèi)分泌疾病史；免疫功能障礙；并發(fā)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、代謝性關(guān)節(jié)??；惡性腫瘤；合并流感、感染性肺炎等其他感染性疾??；2 周內(nèi)服用影響軟骨代謝藥物；近期內(nèi)存在抗風(fēng)濕或免疫抑制劑治療史；近期內(nèi)下肢損傷或手術(shù)者；長(zhǎng)期服用補(bǔ)鈣藥物。

1.2 指標(biāo)觀察

1.2.1 S100B、CTX-Ⅱ水平測(cè)定 采集兩組受檢者體檢當(dāng)日空腹外周靜脈血5 mL，常溫靜置，高速離心（轉(zhuǎn)速：3 000 r/min，半徑：12 cm）10 min，分離上清，采用雙抗體夾心ELISA 法測(cè)定S100B、CTX-Ⅱ水平，設(shè)置酶標(biāo)板為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，每孔加入50 μL 稀釋液，后依次加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣片各50 μL，混勻，覆膜，室溫孵育2 h。棄孔內(nèi)液體，甩干，清洗反應(yīng)板。加入S100B、CTX-Ⅱ檢測(cè)液100 μL/孔，覆膜，常溫孵育60 min，棄孔內(nèi)液體，甩干、洗滌反應(yīng)板，加入100 μL/孔底物溶液，遮光顯色0.5 h，加入終止液，輕彈酶標(biāo)板終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀（型號(hào)iMark，Bio-RAD 公司）450 nm 處測(cè)定吸光值，由高資歷檢驗(yàn)醫(yī)生嚴(yán)格遵循試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 NLRP3 表達(dá)水平測(cè)定 采用RT-PCR 法測(cè)定，microRNA 提取分離試劑盒分離血清總RNA，測(cè)定所得RNA 純度、完整度。采用TaqMan microRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行microRNA 逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Premix ExTaq II kit 進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)火95℃，預(yù)變性30 min，取出降溫至90℃，變性5 s，迅速降溫至58℃，退火20 s，溫度保持60℃，延伸45 s，連續(xù)循環(huán)40次，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算NLRP3 相對(duì)表達(dá)量。β-actin：上游引物：5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'；下游引物：5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，NLRP3：上游引物：5'-CCCCGTGAGTCCCATTA-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間行樣本F檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達(dá)水平比較

相比對(duì)照組，研究組S100B、CTX-Ⅱ水平升高，NLRP3 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達(dá)水平比較（）

表1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達(dá)水平比較（）

2.2 不同Recht 等級(jí)患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達(dá)水平比較

與I 級(jí)、II 級(jí)患者比較，III 級(jí)患者S100B、CTX-Ⅱ水平較高，NLRP3 表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同Recht 等級(jí)患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表達(dá)水平比較（）

表2 不同Recht 等級(jí)患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表達(dá)水平比較（）

2.3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

以S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示S100B、CTX-Ⅱ與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；NLRP3 與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

2.4 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相關(guān)性

膝骨關(guān)節(jié)炎患者S100B、CTX-Ⅱ呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.613,P=0.015）；S100B、NLRP3 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.821,P=0.005）；CTX-Ⅱ、NLRP3 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.765,P=0.007）。見(jiàn)圖1。

圖1 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相關(guān)性

2.5 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值

ROC 曲線分析顯示，與S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 單項(xiàng)診斷相比，三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

圖2 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值

表4 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值

3 討論

臨床醫(yī)學(xué)中將關(guān)節(jié)周?chē)浌鞘芰W(xué)、生物學(xué)等因素所致的退變統(tǒng)稱(chēng)為骨性關(guān)節(jié)炎，為老年人多發(fā)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨損害為主要特征，畸形、持續(xù)性疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙為主要癥狀，對(duì)患者身心健康造成極大影響［10］。但有學(xué)者指出，力學(xué)、生物學(xué)等因素雖可影響膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及進(jìn)展，但任何單一因素均無(wú)法誘發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎，提示膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生或是多因素共同作用所致。故及早且有效評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎病情對(duì)預(yù)防及臨床方案制定具有獨(dú)特意義［11］。

研究指出，S100 家族分子與滑膜炎、骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，但臨床醫(yī)學(xué)尚未明確S100B 在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制［12］。研究指出，S100B 在軟骨損傷軟骨細(xì)胞凋亡及滑膜組織炎癥中發(fā)揮獨(dú)特作用，提示S100B 可通過(guò)干預(yù)細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程，影響生物機(jī)械力學(xué)信號(hào)傳遞；另外S100B 可通過(guò)持續(xù)激活RAGE 破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，參與細(xì)胞炎性反應(yīng)［13-14］。相關(guān)學(xué)者指出，膝骨關(guān)節(jié)炎患者S100B 表達(dá)水平高于健康人員，且S100B 表達(dá)與Recht 標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)存在相關(guān)聯(lián)系，提示S100B 在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者S100B 水平顯著高于健康人員，且S100B 水平隨疾病嚴(yán)重程度分級(jí)升高而增加，證實(shí)S100B 參與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及病理進(jìn)展過(guò)程。分析其原因或?yàn)镾100B 作為炎性機(jī)制參與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，而高表達(dá)S100B 可通過(guò)增加機(jī)體炎癥損傷從而誘發(fā)軟骨病理?yè)p傷。

研究指出，由膠原、聚糖等固相成分組成的軟骨在維持膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整性的破壞是膝骨關(guān)節(jié)炎病變的主要病變表現(xiàn)［16］。作為膝關(guān)節(jié)軟骨膠原中主要成分，CTX-Ⅱ可對(duì)膠原纖維代謝情況反映，從而反映軟骨病理變化［17］。研究發(fā)現(xiàn)，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者CTX-Ⅱ水平異常升高，且其含量變化與半月板、軟骨組織損傷程度存在一定關(guān)聯(lián)；另外CTX-Ⅱ在軟骨損傷早期便呈現(xiàn)異常升高，且其升高趨勢(shì)隨軟骨損害程度增加而增加，推測(cè)其在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清中膝骨關(guān)節(jié)炎呈現(xiàn)出異常上升的趨勢(shì)，且隨骨損害程度增加而升高。結(jié)合上述研究猜想CTX-Ⅱ與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，出現(xiàn)這種情況的原因或?yàn)镃TX-Ⅱ受疾病遷延、軟骨損傷加重而被大量分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，后經(jīng)腎臟排出，致使血液內(nèi)CTX-Ⅱ表達(dá)量增加。

炎性因子在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。NLRP3 炎性小體作為固有免疫組分可對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)作出調(diào)節(jié)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)間隙脂多糖、三磷酸腺苷增加可通過(guò)NLRP3 促進(jìn)膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，提示NLRP3 在膝骨關(guān)節(jié)炎中的異常與炎癥反應(yīng)相關(guān)；另外由于NLRP3 在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及活動(dòng)性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于健康者，推測(cè)NLRP3 在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者NLRP3 表達(dá)水平顯著低于健康者，且其水平變化隨疾病加重而降低，證實(shí)低表達(dá)NLRP3 與膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及病理進(jìn)展相關(guān)。分析其原因或?yàn)榈捅磉_(dá)NLRP3 在膝骨關(guān)節(jié)炎中對(duì)炎癥應(yīng)激過(guò)程發(fā)揮保護(hù)作用相關(guān)。

綜上所述，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及病理進(jìn)展或與血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 異常表達(dá)相關(guān)，可作為評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的潛在生物學(xué)指標(biāo)。