劉春雨，趙云，廖永紅，楊飛飛

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

20(S)-原人參二醇(protopanaxadiol，PPD)為二醇型人參皂苷元，天然來源于人參、西洋參、三七等五加科植物，以及絞股藍(lán)等葫蘆科植物。商品PPD常通過微生物酵解二醇組人參皂苷獲得[1-2]。PPD具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、提高學(xué)習(xí)記憶、抗衰老、抗炎、抗癡呆、抗焦慮、抗抑郁、抗疲勞和促進(jìn)造血等廣泛的藥理活性[1-2]。但PPD水溶性較差，在水中的平衡溶解度僅為35.24 mg·L-1，油水分配系數(shù)(P)為46.21(logP=1.66)，腸灌流模型和細(xì)胞模型表明PPD的膜滲透性好，因此PPD屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中屬于溶解性差，滲透性好的第二類藥物[3]。對(duì)于此類藥物，溶出是藥物吸收的限速步驟，影響藥物口服生物利用度，改善藥物溶出為常用的提高此類藥物生物利用度的制劑方法[4]。文獻(xiàn)報(bào)道了采用納米晶、自微乳和聚合物膠束等手段有效提高PPD溶出和口服生物利用度的研究[5-8]，其中基于納米晶技術(shù)的方法表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。本文擬報(bào)道一種新型PPD固體分散體，其加水復(fù)溶后可轉(zhuǎn)化為納米混懸液，改善PPD的溶解度、溶出度和口服生物利用度。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 E2695-2489高效液相色譜儀(美國Waters公司)；3200 Q-TRAP液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LC-MS/MS(美國Applied Biosystem公司)；Analyst 1.4 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Applied Biosystem公司)；XS105S 十萬分之一電子天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)；Gilson 移液器(法國 Gilson 公司)；Vortex-5 渦旋混勻器(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司)；臺(tái)式微量高速冷凍離心機(jī)(Micro 17R，美國Thermo Scientific公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國 Heidolph公司)。

1.2 試劑 原人參二醇(≥95%，北京博肽未名生物技術(shù)有限公司)；PPD和地高辛標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑有限責(zé)任公司)；乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯共聚64(PVP-VA，上海維酮材料科技有限公司)；D-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯(TPGS，西安海斯夫生物科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；泊洛沙姆188(F68，北京風(fēng)禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司)；色譜級(jí)乙腈和甲醇(德國Merk公司)；無水乙醇(北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 PPD體外含量測定方法 PPD體外含量測定采用HPLC方法，具體條件是色譜柱：Thermo BDSHYPERSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：1 mL·min-1，檢測波長：203 nm，進(jìn)樣量：50 μL，流動(dòng)相：10%水∶90%乙腈。

2.2 PPD固體分散體處方篩選和優(yōu)化 處方篩選擬評(píng)價(jià)F68和TPGS兩種表面活性劑的固體分散體處方。PPD固體分散體采用溶劑蒸發(fā)法制備，具體是按表1稱取處方量的PPD和輔料于圓底燒瓶中，加入適量無水乙醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，圓底燒瓶密封置于-20 ℃冰箱中固化20 min，取出后過200目篩，置干燥器中避光保存。處方優(yōu)化的目的是提高PPD載藥量和減少輔料的用量，具體處方見表2。

表1 PPD固體分散體制備處方組成

表2 PPD固體分散體制備處方優(yōu)化組方

2.3 固體分散體復(fù)溶后的粒徑分布 取10 mg PPD固體分散體復(fù)溶在5 mL人工胃液中，然后用馬爾文激光粒度(ZetasizerNanoZS 90)測定其平衡10 min和放置8 h后的平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)。

2.4 PPD固體分散體片劑的制備 PPD固體分散體在處方中為主藥，每片PPD含量為100 mg。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以壓片物料的流動(dòng)性、片劑的可壓性、崩解時(shí)間及外觀光潔度作為評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量的指標(biāo)，對(duì)分散片的崩解劑、填充劑及潤滑劑的種類及用量進(jìn)行篩選。在單因素考察試驗(yàn)中，按基本處方進(jìn)行試驗(yàn)：PPD固體分散體(含PPD 100 mg)80%、填充劑10%，崩解劑9%、潤滑劑1%。以乳糖、可壓性淀粉和微晶纖維素(MCC)為填充劑，硬脂酸鎂為潤滑劑，崩解劑選擇羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)、交聯(lián)聚維酮(PPVP)或交聯(lián)羧甲纖維素鈉(CC-Na)。

采用直接壓片法制備固體分散體片劑。具體是將PPD固體分散體過80目篩，其他輔料過100目篩，按處方量分別稱取主藥PPD固體分散體及各種輔料，混合均勻，最后加上潤滑劑過100目篩，混合均勻，檢驗(yàn)合格后壓片即可。取PPD固體分散片，照崩解時(shí)限檢查法[《中國藥典》2015年版(二部)附錄XA]，測定片劑崩解時(shí)間。

2.5 PPD固體分散片體外溶出試驗(yàn) 比較優(yōu)化后的固體分散體和原藥經(jīng)相同處方物理混合壓片的片劑的體外溶出度。分別取兩種自制片各6 片，以純水為溶出介質(zhì)，參照《中國藥典》2015 年版片劑溶出度測定法(漿法)進(jìn)行考察。溶出介質(zhì)為500 mL，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，溫度設(shè)置為(37±2)℃，分別在第15、30、60、90、120、240、360、480 min 取樣，用微孔濾膜過濾，濾過液經(jīng)90%的甲醇溶液稀釋后，用HPLC進(jìn)樣分析。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)要指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。雄性Wistar大鼠(180～220 g，8周)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK-京2012-0001)，實(shí)驗(yàn)前在SPF動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。所有動(dòng)物均保持在控制溫度(22±2)℃，12 h光照/黑暗周期，并自由飲食和飲水。

2.6.2 頸靜脈插管手術(shù) 將大鼠腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥鈉生理鹽水溶液，深度麻醉后，在右嘴角向鎖骨處做一條垂線，在交點(diǎn)上方約0.5 cm的部位，用剪刀將皮膚剪開一個(gè)1 cm 左右的切口，鈍性分離頸靜脈，并將其遠(yuǎn)心端結(jié)扎，在頸靜脈竇遠(yuǎn)心方向約0.5 cm處剪一個(gè)小切口，沿切口處向心臟方向插入約2.5 cm的聚乙烯管(ID 0.5 mm，OD 1 mm，英國Portex公司)，并將聚乙烯管末端沿皮下在背部導(dǎo)出，用肝素生理鹽水溶液封管，結(jié)扎固定，縫合開口。術(shù)后至少恢復(fù)12 h以上。所有動(dòng)物給藥前禁食不禁水。

2.6.3 大鼠口服灌胃給藥和取血樣 雄性Wistar大鼠插管手術(shù)恢復(fù)后隨機(jī)分成2組，每組6只，標(biāo)號(hào)后灌胃給予PPD固體分散片和PPD物理混合片劑。給藥前片劑按3 mg?mL-1的PPD濃度分散在水中，給藥體積為10 mL·kg-1灌胃給藥，相當(dāng)于PPD劑量為30 mg·kg-1。給藥后分別在15、30、45、60、120、180、240、360、720 min時(shí)間點(diǎn)從頸靜脈置留管中取全血約0.12 mL放于含有抗凝劑肝素的EP管中，5 000 r·min-1離心5 min收集得50 μL血漿，冷凍儲(chǔ)存待用。

2.6.4 樣品處理方法 取50 μL血漿置于2 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)地高辛(250 μg·mL-1)10 μL和40 μL磷酸緩沖液，渦旋震蕩5 min。加入二氯甲烷1.5 mL，渦旋震蕩10 min，12 000 r·min-1離心5 min，小心吸取溶液，高純氮?dú)獯蹈蓳]發(fā)掉有機(jī)溶劑，殘?jiān)尤?00 μL 80%甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清經(jīng)HPLC-MS/MS分析檢測。

2.6.5 LC-MS/MS血漿樣品分析方法 LC-MS/MS血漿樣品分析方法采用作者前期報(bào)道的方法[11]。

2.6.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用WinNonlin軟件(版本6.1，美國Pharsight公司)計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。包括最高血藥濃度(Cmax)，最高血藥濃度時(shí)間(Tmax)，半衰期(t1/2)和生物利用度(AUC0～t)。

3 結(jié)果

3.1 PPD固體分散體處方優(yōu)化 PPD和PVP或PVP-VA溶于乙醇溶液后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮干燥后可形成固體分散體，復(fù)溶于水后，藥物溶液沉淀。當(dāng)在其中加入F68或TPGS后，復(fù)溶后可形成納米混懸液。尤其是在PVP-VA中加入TPGS后，固體分散體復(fù)溶后可形成平均粒徑小于120 nm的納米混懸液(見表3)。因此進(jìn)一步處方優(yōu)化選用PVP-VA作為固體分散體的分散載體材料?？紤]到表面活性劑可能對(duì)胃腸道存在一定的毒副作用，在處方優(yōu)化時(shí)，表面活性劑用量盡量減小。

表3 不同固體分散體處方粒徑結(jié)果

表4 不同固體分散體處方粒徑結(jié)果

3.2 PPD固體分散片處方優(yōu)化 優(yōu)選的PPD固體分散體可直接壓成片劑，但片劑遇水后黏性很大，難以崩解。因此考慮在壓片時(shí)加入一定量的常用崩解劑和填充劑。在CMS-Na、CCNa和PPVP 3種崩解劑中，CMS-Na和CCNa的崩解效果不顯著，而PPVP吸水膨脹性強(qiáng)，觀察結(jié)果顯示其有很好的崩解效果(見表5)，因此選用PPVP為PPD固體分散體片劑的崩解劑。

在常用片劑輔料中，MCC既可作填充劑，還具有一定促崩解作用，本研究中，使用MCC的PPD片劑表面光滑，可壓性優(yōu)于其他輔料，但使用MCC的片劑反而不易崩解。和可壓性淀粉相比，乳糖的可壓性和崩解性能均優(yōu)于淀粉，因此選擇乳糖作為填充劑。當(dāng)固定崩解劑和填充劑總量為處方量為19%，乳糖∶PPVP為1∶3時(shí)，崩解時(shí)間可縮短至約9 min，且可壓性良好(見表5)。由此確定PPD固體分散片優(yōu)化處方為：PPD固體分散體PVP-VA-TPGS-2 80%、填充劑乳糖4%、崩解劑PPVP 15%、潤滑劑硬脂酸鎂1%，片劑中PPD的含量為25%。

表5 輔料對(duì)片劑性能的影響篩選結(jié)果

對(duì)優(yōu)化后的固體分散片，以及基于固體分散材料物理混合的片劑進(jìn)行了體外溶出試驗(yàn)。在物理混合的片劑中，PPD原藥的平均粒徑為(17.4±0.8)μm。從圖1中的溶出結(jié)果可知，固體分散片在15 min時(shí)溶出量超過了90%，而物理混合的片劑15 min時(shí)只有約10%的藥物溶出。需要注意的是，溶出的藥物是以納米混懸的形式存在，而不是藥物分子形式溶出，因?yàn)槿艹鲆翰捎?.22 μm濾膜過濾，分散體復(fù)溶形成的納米?？山?jīng)濾膜過濾。

圖1 PPD固體分散體和物理混合物的體外溶出曲線

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果 大鼠口服PPD固體分散體和物理混合物的藥-時(shí)曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見圖2和表6。由結(jié)果可知，固體分散體口服給藥后可快速吸收入血，達(dá)峰時(shí)間為30 min，而物理混合物的PPD則顯示出緩慢吸收的特性，沒有明顯的達(dá)峰時(shí)間。固體分散體的快速溶出顯著提高了其最高血藥濃度達(dá)6.59倍，同時(shí)其相對(duì)生物利用度也是物理混合物的2.54倍。

圖2 PPD固體分散體和物理混合物以30 mg·kg-1劑量經(jīng)大鼠口服給藥后的藥時(shí)曲線

表6 PPD固體分散體和物理混合物以30 mg·kg-1劑量經(jīng)大鼠口服給藥后的的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 討論

固體分散技術(shù)可以顯著增加難溶性藥物的溶解度和溶出速率，提高藥物生物利用度。人參皂苷元PPD在水中的溶解度低，通過固體分散技術(shù)，提高其在水中的溶解度。口服固體分散體在胃腸道復(fù)溶后，藥物形成過飽和溶液。溶解后的藥物分子經(jīng)歷吸收和重結(jié)晶兩個(gè)過程的相互競爭[9]。傳統(tǒng)的固體分散技術(shù)是通過選擇適當(dāng)?shù)妮o料材料，延長藥物在胃腸道的過飽和狀態(tài)，抑制藥物重結(jié)晶，從而提高難溶性藥物的口服生物利用度。但延長藥物的過飽和狀態(tài)并不容易，一般載藥量超過5%時(shí)，很難形成穩(wěn)定的過飽和溶液。

本文研究了一種新型溶出機(jī)制的固體分散體。在固體分散體復(fù)溶時(shí)，不是通過提高過飽和溶液的穩(wěn)定性，而是加速過飽和溶液中藥物重結(jié)晶，通過控制重結(jié)晶后藥物的粒徑，使其形成穩(wěn)定的納米混懸液，提高PPD的溶出特性。當(dāng)TPGS用量從處方量的33%減少到20%時(shí)，復(fù)溶后的納米混懸液平均粒徑略有增加，從約(101.6±4.2)nm增大到(115.1±1.5)nm，納米混懸液放置8 h后略有增大，分別增大到(124.3±2.9)nm和(136.7±0.7)nm。當(dāng)繼續(xù)降低TPGS的用量時(shí)，復(fù)溶的納米混懸液的粒徑開始增大，并且在酸性介質(zhì)中放置8 h下出現(xiàn)沉淀。因此，優(yōu)選的固體分散體處方PPD∶PVP-VA∶TPGS組成為100∶140∶60。固體分散體中加入表面活性劑可抑制藥物結(jié)晶，并提高終產(chǎn)品片劑的物理穩(wěn)定性。當(dāng)終產(chǎn)品進(jìn)行溶出測試時(shí)，在沒有考慮復(fù)溶溶劑的漏槽條件情況下形成至少穩(wěn)定8 h的納米混懸劑。

體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固體分散體經(jīng)大鼠口服后可以顯著提高PPD的口服生物利用度。利用控制結(jié)晶法制備PPD納米晶提高藥物溶出特性和口服生物利用度的方法已有研究報(bào)道。在該研究中，Chen等[10]利用反溶劑法將溶有高濃度PPD的有機(jī)溶劑滴加到含有保護(hù)劑的水相中，PPD可通過控制重結(jié)晶過程制備藥物納米晶，含有表面活性劑作為保護(hù)劑的PPD納米晶混懸液的Cmax和生物利用度分別是原藥制劑4.74倍和1.81倍。在本研究中，固體分散體Cmax和生物利用度分別是原藥及輔料物理混合物的6.59倍和2.54倍，說明固體分散體原位形成的納米混懸液具有更好的增溶作用。同時(shí)，本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)固體分散體不含表面活性劑時(shí)，復(fù)溶后的藥物迅速重結(jié)晶形成大的顆粒而沉淀；而加入表面活性劑可控制PPD結(jié)晶后的粒徑大小，比較而言，加入TPGS可形成比F68更小的納米顆粒。這一采用表面活性劑控制結(jié)晶的策略和文獻(xiàn)納米晶的制備方法基本一致，并具有類似的控制效果[11]。和納米晶口服藥物制劑相比，本研究中的可轉(zhuǎn)化為納米混懸劑的固體分散體具有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：首先制備簡單，可直接通過真空干燥法制備固體分散體，然后制備為片劑；其次所需的表面活性劑的用量更低，因?yàn)榛诠腆w分散體的納米混懸劑是在溶出部位原位形成的，局部的表面活性濃度高，因此需要的表面活性劑用量更低。