王冰艷 劉愛芬 孫鳳仙

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院麻醉科，天津 300211

阿爾茨海默病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，也是老年期常見疾病，主要表現(xiàn)為記憶障礙、失語、視空間能力損害、認知功能障礙等，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，阿爾茨海默病發(fā)病率與年齡有關(guān)，年齡每增加6 歲，發(fā)病率可升高1 倍，且85 歲以后病發(fā)率高達30%［1-2］。阿爾茨海默病發(fā)病原因尚不明確，研究認為，可能與神經(jīng)細胞炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、β-淀粉樣蛋白沉積等有關(guān)［3］。依托咪酯是靜脈麻醉藥，因具有鎮(zhèn)痛好、起效快等特點用于臨床麻醉，研究顯示，依托咪酯對老年術(shù)后認知功能障礙無影響［4］。還有研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯呈劑量依賴性抑制大鼠脊髓神經(jīng)興奮，并降低煙堿型乙酰膽堿受體表達，但目前關(guān)于依托咪酯對阿爾茨海默病的動物研究還不明確［5］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路是經(jīng)典信號通路，可通過降低相關(guān)通路蛋白表達發(fā)揮保護腦神經(jīng)元的作用，從而有效減輕阿爾茨海默病發(fā)展［6］。關(guān)于依托咪酯與MAPK/ERK 信號通路調(diào)控作用目前尚無明確報道，鑒于此，本研究主要探究依托咪酯可能通過調(diào)控MAPK/ERK 信號通路對阿爾茨海默病小鼠認知功能、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響。

資料與方法

1、實驗動物

50 只SPF 級APP/PS1 轉(zhuǎn)基因雌雄各半小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK（京）2014-0004，12 月齡。10 只 SPF 級 C57BL/6 雌雄各半小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006，12月齡。實驗動物飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，自由進食飲水，晝夜交替各12 h，適應(yīng)2周后可進行實驗。本研究于2020年5月至2021年9月進行。

2、主要試劑

依托咪酯購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（國藥準字H32022379，規(guī)格10 ml∶20 mg）；鹽酸多奈哌齊購于植恩生物技術(shù)股份有限公司（國藥準字H32022379，規(guī)格10 mg）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體（ab183218）、白細胞介素（IL）-1β 抗體（ab254360）、IL-10 抗體（ab133575）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（ab8245）、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）1/2 抗體（ab278538）、ERK1/2 抗體（ab184699）、磷 酸 化 p-p38 抗 體（ab178867）、p38 抗 體（ab170099）購于美國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購于上海研卉生物；放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、化學發(fā)光液購于北京索萊寶公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購于上海廣銳生物。

3、動物分組

將 50 只 SPF 級 APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠分為 5 組：模型組、依托咪酯低、中、高劑量組、陽性對照組，SPF 級C57BL/6 小鼠作為對照組。其中依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，灌胃30 d。

4、Morris水迷宮實驗

采用Morris 水迷宮實驗觀察檢測小鼠學習、記憶能力。Morris 水迷宮裝置，直徑180 cm、高55 cm 圓形黑色水池，水深30 cm，距水池壁35 cm 放置一個高29 cm、直徑10 cm 的圓臺。定位導航實驗：將小鼠放置4 個不同位點，背對水池壁放入水池中，讓小鼠自由游泳尋找平臺，記錄小鼠找到平臺時間，即為逃避潛伏期，若在120 s內(nèi)未找到平臺，需將小鼠引至平臺停留10 s，連續(xù)進行5 d。空間探索實驗：第5 天小鼠訓練結(jié)束后撤出平臺，小鼠放在同一入水點，觀察檢測120 s內(nèi)跨平臺次數(shù)、平臺區(qū)停留距離。

5、神經(jīng)損傷評分測定

各組小鼠灌胃4 周后進行神經(jīng)損傷評分，參考Zea-Longa's 評分標準［7］。分數(shù)為 0～4 分，4 分：不能自主行走，且存在意識障礙；3 分：小鼠軀體左側(cè)癱瘓，行走時向左側(cè)傾倒；2 分：行走時小鼠軀體向左側(cè)（癱瘓）轉(zhuǎn)圈；1 分：小鼠左側(cè)前爪不能完全伸展；0 分：行為正常，無神經(jīng)功能缺損。

6、腦組織含水量測定

各組小鼠喂養(yǎng)30 d 后斷頭處死小鼠腦組織，通過干濕法檢測小鼠腦組織含水量。取小鼠腦組織100 mg 稱重，即濕重；110 ℃烘箱放置24 h，取出腦組織稱重，即干重。計算腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

7、蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測TNF-α、IL-10、IL-1β、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38蛋白的表達

取小鼠腦組織，加入RIPA 裂解液進行裂解，12 000×g離心15 min，經(jīng)BCA 法檢測蛋白濃度，取上樣蛋白添加至上樣槽內(nèi)，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉90 min，加入TNF-α（稀釋 1∶500）、IL-10（稀釋 1∶800）、IL-1β（稀釋 1∶500）、p-ERK1/2（稀釋 1∶600）、ERK1/2（稀釋1∶600）、p-p38（稀釋1∶600）、p38（稀釋1∶600）和GAPDH（稀釋1∶2000）抗體稀釋液，4 ℃過夜孵育，于次日HRP 標記的二抗（稀釋1∶5 000）37 ℃孵育90 min。最后加入化學發(fā)光液顯色、曝光，使用Image J軟件分析蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)參。

8、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測氧化應(yīng)激指標

取小鼠腦組織，制備成勻漿液，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm）后取上清，按照ELISA 試劑盒說明書步驟檢測SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、MDA含量。

9、統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0 分析實驗數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組內(nèi)間比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、各組小鼠Morris水迷宮試驗比較

與對照組相比，模型組的逃避潛伏期均明顯延長，跨平臺次數(shù)、平臺區(qū)停留距離均降低（均P＜0.05）；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組及陽性對照組的逃避潛伏期均明顯縮短，跨平臺次數(shù)、平臺區(qū)停留距離均升高（均P＜0.05）。具體見表1、表2。

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（s，）

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（s，）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF級C57BL/6小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

第5天15.43±1.92 37.18±2.68a 29.42±2.59b 26.25±2.32b 19.43±1.87 20.44±2.30 118.043＜0.001組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10第1天62.38±6.82 89.47±9.88a 83.17±7.24 76.75±5.89b 70.24±5.78b 72.51±6.94b 16.322＜0.001第2天58.42±3.47 80.21±6.85a 66.74±5.37b 59.43±4.62b 52.17±3.38b 50.32±4.18b 52.406＜0.001第3天40.24±3.82 68.47±5.72a 49.24±4.82b 40.19±3.25b 32.70±2.36b 31.24±3.21b 116.905＜0.001第4天26.71±2.52 43.82±3.74a 38.70±3.21b 32.24±2.58b 23.42±2.08b 24.59±2.47b 85.516＜0.001

表2 各組小鼠空間探索能力比較（s，）

表2 各組小鼠空間探索能力比較（s，）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF 級C57BL/6 小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

平臺區(qū)停留距離（cm）11.02±1.89 2.99±0.74a 4.52±0.56b 6.79±0.68b 9.62±0.92b 9.89±0.43b 105.922＜0.001組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10跨平臺次數(shù)（次）10.70±1.64 2.60±0.94a 4.20±0.92b 6.20±1.03b 7.40±0.80b 7.50±1.08b 65.894＜0.001

2、各組小鼠神經(jīng)損傷評分、腦組織含水量的比較

與對照組相比，模型組的神經(jīng)損傷評分、腦組織含水量均增加（均P＜0.05）；與模型組比較，依托咪酯中、高劑量組及陽性對照組的神經(jīng)損傷評分、腦組織含水量均降低（均P＜0.05）。具體見表3。

表3 各組小鼠神經(jīng)損傷評分、腦組織含水量比較（）

表3 各組小鼠神經(jīng)損傷評分、腦組織含水量比較（）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF 級C57BL/6 小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

腦組織含水量（%）68.47±5.29 88.71±6.93a 83.17±5.44 78.43±4.67b 72.11±3.82b 71.39±4.23b 22.918＜0.001組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10神經(jīng)損傷評分（分）0 3.11±0.42a 2.75±0.23b 1.97±0.28b 1.14±0.18b 0.98±0.25b 204.921＜0.001

3、各組小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標比較

與對照組相比，模型組的SOD、CAT、GSH-Px 活性均降低，MDA 含量增加（均P＜0.05）；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組及陽性對照組的SOD、CAT、GSH-Px 活性均增加，MDA含量均降低（均P＜0.05）。具體見表4。

表4 各組小鼠氧化應(yīng)激水平比較（）

表4 各組小鼠氧化應(yīng)激水平比較（）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF級C57BL/6小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

丙二醛含量（nmol/mg）2.17±0.34 8.42±0.87a 6.52±0.49b 5.19±0.44b 3.73±0.45b 3.27±0.38b 192.917＜0.001組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10超氧化物歧化酶活性（U/mg）92.35±10.24 43.12±3.64a 50.22±4.85b 65.37±6.71b 81.46±7.30b 73.14±8.89b 65.522＜0.001過氧化氫酶活性（U/mg）16.77±2.08 4.26±0.42a 7.20±0.74b 11.94±1.12b 14.87±1.50b 13.42±1.67b 120.457＜0.001谷胱甘肽過氧化物酶活性（U/mg）78.46±7.88 30.14±3.32a 38.59±3.63b 53.12±4.89b 67.67±5.82b 70.21±7.38b 110.078＜0.001

4、各組小鼠腦組織炎性反應(yīng)比較

與對照組相比，模型組的TNF-α、IL-10、IL-1β 蛋白表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組及陽性對照組的TNF-α、IL-10、IL-1β 蛋白表達均降低（P＜0.05）。具體見圖1、表5。

表5 各組小鼠炎性反應(yīng)比較（）

表5 各組小鼠炎性反應(yīng)比較（）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF 級C57BL/6 小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

白細胞介素-1β 0.16±0.04 0.75±0.06a 0.59±0.07b 0.43±0.05b 0.28±0.04b 0.31±0.04b 180.152＜0.001組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10腫瘤壞死因子-α 0.23±0.03 0.87±0.07a 0.70±0.06b 0.56±0.05b 0.38±0.04b 0.35±0.06b 202.772＜0.001白細胞介素-10 0.19±0.03 0.72±0.06a 0.61±0.05b 0.46±0.04b 0.32±0.04b 0.29±0.05b 195.291＜0.001

圖1 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組小鼠TNF-α、IL-10、IL-1β蛋白表達

5、各組小鼠腦組織MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達比較

與對照組相比，模型組的p-ERK1/2、p-p38蛋白表達均降低（均P＜0.05）；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組及陽性對照組的p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達均增加（均P＜0.05）。具體見圖2、表6。

表6 各組小鼠MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

表6 各組小鼠MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達比較（）

注：模型組，依托咪酯低、中、高劑量組，陽性對照組均為APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠；對照組為SPF 級C57BL/6 小鼠；依托咪酯低、中、高劑量組分別給予1.0、2.5、5.0 mg/kg 依托咪酯灌胃，陽性對照組給予10 mg/kg 鹽酸多奈哌齊灌胃，模型組、對照組給予等體積生理鹽水灌胃；p-ERK 為磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，ERK 為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

p38 0.99±0.11 0.95±0.10 1.01±0.17 0.96±0.09 0.98±0.10 0.99±0.09 0.373 0.865組別對照組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組陽性對照組F值P值只數(shù)10 10 10 10 10 10 p-ERK1/2 1.35±0.13 0.38±0.05a 0.49±0.04b 0.73±0.05b 0.98±0.10b 1.02±0.11b 172.882＜0.001 ERK1/2 1.33±0.16 1.31±0.15 1.29±0.20 1.33±0.17 1.34±0.11 1.33±0.18 0.125 0.986 p-p38 0.96±0.10 0.28±0.06a 0.35±0.05b 0.64±0.07b 0.82±0.06b 0.83±0.05b 170.185＜0.001

圖2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組小鼠p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38蛋白表達

討 論

阿爾茨海默病是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，越來越多研究結(jié)果顯示，其病理特征與β-淀粉樣蛋白聚集、神經(jīng)細胞損傷等有關(guān)［8-10］。目前關(guān)于阿爾茨海默病體內(nèi)、體外研究多種多樣，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠能更好地模擬體內(nèi)阿爾茨海默病病理特征，近年被廣泛應(yīng)用［11］。APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠是利用突變或野生APP、PS1 基因?qū)⑵鋵胄∈篌w內(nèi)，當小鼠體內(nèi)雙基因表達過多時可引起β-淀粉樣蛋白沉積，導致小鼠腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)病理性損害［12］。本研究為了更好地模擬體內(nèi)阿爾茨海默病，使用APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠進行實驗，選擇同月齡C57BL/6 小鼠作為對照，用Morris水迷宮實驗觀察小鼠的學習、記憶能力，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠逃避潛伏期均明顯延長，且跨平臺次數(shù)、平臺區(qū)停留距離也均降低，腦組織含水量升高，且神經(jīng)損傷評分表現(xiàn)出重度神經(jīng)功能損害，這與Ou等［12］研究一致。

研究認為，腦組織神經(jīng)元與認知功能、記憶能力等有關(guān)，正常情況下神經(jīng)元可替換凋亡的神經(jīng)元，但阿爾茨海默病患者因腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元萎縮，導致神經(jīng)元釋放發(fā)生氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，造成神經(jīng)元細胞異常凋亡，可加重疾病發(fā)展［13-14］。SOD、CAT、GSH-Px 是機體內(nèi)抗氧化物酶，可有效清除體內(nèi)氧化產(chǎn)物，從而提高機體抗氧化能力；MDA是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，可作為氧化應(yīng)激指標［15］。神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激后還促進細胞釋放更多TNF-α、IL-10、IL-1β 等因子，從而激活炎性反應(yīng)發(fā)生，導致神經(jīng)元細胞損傷加重［16］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px 活性降低，MDA 含量增加，且TNF-α、IL-10、IL-1β蛋白表達上調(diào)，這與Meng、Qiu等［15-16］研究結(jié)果一致。

依托咪酯是臨床常用靜脈麻醉藥物，具有作用時間短等特點，且對循環(huán)系統(tǒng)、血流動力學、認知功能影響小，臨床可用于老年術(shù)后、危重癥患者［17］。研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯可用于治療老年脊柱手術(shù)患者，可保證患者血流動力學穩(wěn)定，并減輕氧化應(yīng)激、提高術(shù)后認知功能［18］。還有研究發(fā)現(xiàn)，依托咪酯可提高新生大鼠認知功能，并增加煙堿型乙酰膽堿受體表達［19］。本研究結(jié)果顯示，不同劑量依托咪酯灌胃小鼠后，呈劑量依賴性改善小鼠腦組織認知功能，并增加SOD、CAT、GSH-Px 活性，降低MDA 含量及下調(diào)TNF-α、IL-10、IL-1β 蛋白表達，可見，依托咪酯可改善阿爾茨海默病小鼠認知功能，這與楊青青等［19］研究結(jié)果相似，且本研究還發(fā)現(xiàn)其還可提高小鼠抗炎、抗氧化能力。MAPK/ERK 信號通路是近年來在疾病研究中使用比較廣泛，研究顯示，MAPK/ERK 信號通路被激活對阿爾茨海默病大鼠腦組神經(jīng)元具有保護作用［20］。研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷可能通過激活ERK 信號通路抑制阿爾茨海默病大鼠腦組織炎性損傷，并減少神經(jīng)元細胞凋亡［21］。本研究以MAPK/ERK信號通路為切入點，并探究依托咪酯與MAPK/ERK 信號通路對阿爾茨海默病的作用機制，結(jié)果顯示，模型組內(nèi)p-ERK1/2、p-p38蛋白表達上調(diào)，給予小鼠灌胃不同劑量依托咪酯可增加p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達，表明依托咪酯可通過激活MAPK/ERK信號通路參與阿爾茨海默病的發(fā)展。

綜上所述，本研究證實依托咪酯能改善阿爾茨海默病小鼠認知功能，并減輕小鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，作用機制可能與激活MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)，但關(guān)于依托咪酯對阿爾茨海默病小鼠具體機制研究需要后續(xù)探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突