朱浩天，金美秀，唐文思，蘇芳，李陽光

（1.遼寧師范大學化學化工學院,大連 116029；2.多金屬氧酸鹽與網(wǎng)狀材料化學教育部重點實驗室,東北師范大學化學學院,長春 130024）

多金屬氧酸鹽或多酸（Polyoxometalates，POMs）是一類特殊的多齒含氧配體，可與過渡金屬（TM）形成結(jié)構可調(diào)控的配合物，是構建有機-無機雜化材料優(yōu)選的無機建筑單元.由于其結(jié)構中的多原子處于高氧化態(tài)及陰離子的高負電荷，使其顯示出良好的電子貯存和攜傳能力，是優(yōu)秀的光、電、磁材料［1～3］.另外，POMs可與其它多種材料，如碳材料、氮化碳等復合［4～6］，獲得高性能不溶性復合材料.多酸基材料多用于催化領域，是光或光電催化、有機合成催化的良好催化劑［7～11］.目前，多酸基材料的應用領域愈加廣泛.

POMs結(jié)構穩(wěn)定、催化活性高，是環(huán)境友好型催化劑，并且與生物分子之間也具有一定的生物相容性.在POM體系中引入有機或無機修飾基團，實現(xiàn)多酸結(jié)構調(diào)控，能明顯改善和提高POMs的性能.如，Zhang等［12］制備了一種介孔氧化鋯-POM鹽ZrO2-P8W48，利用其與糖蛋白之間的相互作用成功地從蛋清和人血清樣品中分離糖蛋白；Li等［13］通過靜電紡絲法合成了POM修飾的殼聚糖納米纖維（H5PMo10V2O40/殼聚糖納米纖維，簡稱HPMoV/CS-f），實現(xiàn)了5-羥甲基糠醛高效氧化制備2，5-二甲?；秽?；Du等［14］以Cu-聯(lián)咪唑（H2biim）配陽離子片斷修飾Preyssler型｛ZP5W30｝（Z=Na，Ag）簇，得到2例拓展結(jié)構的POMs，通過簡單的物理吸附法負載HRP，實現(xiàn)了所制備的固定化酶對H2O2的痕量檢測.我們研究發(fā)現(xiàn)［14，15］，具有平面結(jié)構的H2biim分子在POM體系中可形成多種類型的氫鍵，從而強化POM對生物大分子的作用，但因其在酸性條件下易質(zhì)子化，遇POM陰離子時發(fā)生沉淀，一般條件下很難進入POM體系中，更難獲得晶體材料.在水熱條件下，這種沉淀作用可被有效抑制.

在前期工作基礎上［15］，本文繼續(xù)嘗試以Dawson型鎢磷酸鉀鹽K6［α-P2W18O62］·14H2O（縮寫為K-P2W18）為起始物，將TM和H2biim引入多酸體系，利用水熱法合成了2例Dawson型晶態(tài)POM基有機-無機雜化材料［Ni（H2biim）3］4［Ni（H2biim）2（P2W18O62）2］·2H2O（1）和［CoIII（H2biim）3］2［P2W18O62］·8H2O（2）；通過直接沉淀法合成了3例Dawson型POM基雜化材料，分別為［Cu（H2biim）2］3［P2W18O62］·4H2O（3），［CoII（H2biim）3］2H2［P2W18O62］·9H2O（4）和［Ni（H2biim）3］3［P2W18O62］·2H2O（5）.此外，將它們作為辣根過氧化物酶（HRP）固定化載體，探究了固定化酶檢測H2O2的性能.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

參照文獻［16］方法合成母體化合物K-P2W18.HRP（同工酶C，P105528產(chǎn)品，K1506050批次，E.C.1.11.1.7，300 U/mg，RZ＞3.0，Mw≈40 kDa）、異硫氰酸羅丹明B（RhBTC）和4-氨基安替比林（4-AAP），上海阿拉丁生化科技有限公司；苯酚（Phenol）、30%H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4和H3PO4，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；不同pH值（3.5～8.5）的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L），使用以上磷酸及磷酸鹽配制.

Bruker Smart APEXⅡ型單晶X射線衍射儀（SC-XRD）和Bruker AXS TENSOR-27型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），德國Bruker公司；Pyris Diamond TG-GTA型熱重-差熱綜合分析儀（TG-DTA）和Perkin Elmer Lambda 35型紫外-可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司；Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡（LSCM），德國Zeiss公司.

1.2 化合物1～5的合成

1.2.1 化合物1的合成將NiCl2·6H2O（0.070 g，0.29mmol）、H2biim（0.033g，0.25mmol）和蒸餾水（10.0 mL）混合，攪拌15 min，然后加入10.0 mL預先配制的K-P2W18（0.400 g，0.085 mmol）水溶液.將所得混合液于80℃攪拌2 h后轉(zhuǎn)入20 mL帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應釜中，密封后于180℃恒溫反應3 d.緩慢冷卻至室溫后離心分離，得到褐色塊狀晶體，產(chǎn)率約45%（以W計）.

1.2.2 化合物2的合成將CoCl2·6H2O（0.214 g，0.9 mmol）溶于蒸餾水（20.0 mL）中，在攪拌下緩慢加入H2biim（0.0604 g，0.45 mmol），攪拌1 h后加入10.0 mL K-P2W18（1.0183 g，0.21 mmol）水溶液，繼續(xù)攪拌1 h，將所得混合液轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應釜中，密封后于120℃恒溫反應3 d.緩慢冷卻至室溫后離心分離，得到橙色塊狀晶體，產(chǎn)率約60%（以W計）.

1.2.3 化合物3～5的合成參考文獻［15，17］方法，先合成配合物［Cu（H2biim）2］Cl2，［Co（H2biim）3］Cl2和［Ni（H2biim）3］Cl2.將［Cu（H2biim）2］Cl2（0.416 g，1.033 mmol）溶于40.0 mL溫水中得到A溶液，將KP2W18（1.581 g，0.344 mmol）溶于40.0 mL溫水中得到B溶液.然后，在攪拌下將B溶液緩慢滴加到A溶液中，立即有沉淀生成.滴加完畢后，將含有沉淀的反應液冷卻至室溫，過濾、自然干燥后，得到綠色粉末（化合物3）.

化合物4和5的合成方法與化合物3基本相同，只是分別用［Co（H2biim）3］Cl2和［Ni（H2biim）3］Cl2代替［Cu（H2biim）2］Cl2，其產(chǎn)物為別為紅色粉末（化合物4）和淺棕色粉末（化合物5）.

1.3 化合物1和2的晶體數(shù)據(jù)收集

選取表面干凈、無裂痕的形狀規(guī)則、透明度好的化合物1和2的單晶，在室溫下利用Bruker Smart APEXⅡ型單晶X射線衍射儀收集晶體數(shù)據(jù)（MoKα，λ=0.071013 nm）；利用SHELXTL-2014程序完成數(shù)據(jù)分析、計算和校正［18］；晶體解析中的非氫原子坐標采用最小二乘法進行修正；水分子及其上的氫原子可依據(jù)單晶解析和熱重分析綜合結(jié)果給出，直接添加在分子式中.另外，通過理論計算方法在N和C上加氫.化合物1和2的晶體學數(shù)據(jù)列于表1.

Table 1 Crystal and refinement data for compounds 1 and 2

1.4 酶的固載及固定化酶活性測定

根據(jù)文獻［14，19，20］報道的酶固定化方法，選擇HRP作為模型酶，化合物1～5分別為載體，采用直接吸附法制備固定化酶（HRP/1～HRP/5）.選用Worthington法［21］評價酶活性，該方法是基于酶催化H2O2氧化苯酚與4-AAP的顯色反應，進而利用分光光度法進行定性及定量分析，具體方法參照文獻［14］.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構描述

圖1和圖2分別為化合物1和2的多面體-球棍圖.從圖1（A）可以看出，化合物1中含有2個［P2W18O62］6-雜多陰離子單元，并通過2個［Ni（H2biim）2］2+配陽離子基團相互連接，其外圍有2對對稱的游離的［Ni（H2biim）3］2+配陽離子和2個H2O分子，形成對稱的二聚體結(jié)構.結(jié)構中的6個Ni（Ⅱ）離子均為六配位，但其連接方式不同.其中Ni1分別與2個H2biim中的4個N和2個［P2W18O62］6-雜多陰離子單元中的2個端氧相連；而游離的4個［Ni（H2biim）3］2+配陽離子中Ni2和Ni3分別與來自3個H2biim分子中的6個N原子配位.分子間通過靜電引力和氫鍵相互作用［d（N—H···O/OW）=0.257（5）～0.324（2）nm］堆積形成三維（3D）結(jié)構，如圖1（B）所示.

Fig.1 Coordination environment(A)and the 3D structure(B)of compound 1

SC-XRD分析結(jié)果表明，化合物2由1個Dawson型陰離子［P2W18O62］6-、2個［Co（H2biim）3］3+配陽離子和8個結(jié)晶水組成.在溶液中可能由于多酸的強氧化性，Co（Ⅱ）被氧化成Co（Ⅲ），該結(jié)果可由價鍵計算和電荷平衡得以驗證［22，23］.［Co（H2biim）3］3+配陽離子圍繞在Dawson型陰離子［P2W18O62］6-周圍形成荷移鹽.每個［Co（H2biim）3］3+配離子中，Co配位中心與3個H2biim分子所提供的6個N配位，形成扭曲的八面體幾何構型［∠N—Co—N=81.9（9）°～94.1（10）°］.相鄰的Dawson型雜多陰離子［P2W18O62］6-通過與H2biim之間的氫鍵［d（N—H···O）=0.256（6）～0.307（3）nm］以及較強的靜電作用形成3D超分子結(jié)構（圖2）.化合物1和2的主要晶體學數(shù)據(jù)參見CCDC 2171851和2171852.另外，根據(jù)合成時添加的物料比，通過IR和TG-DTA分析并依據(jù)電荷平衡原理，計算得出化合物3～5的分子式.

Fig.2 3D structures of compound 2 along a(A)and c(B)directions

2.2 表 征

2.2.1 FTIR光譜分析圖3顯示了化合物1～5的FTIR光譜.3550～3342 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰歸屬于H2O分子中O—H的伸縮振動；3139～2788 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰歸屬于H2biim分子中C—H和N—H的伸縮振動［24，25］；1635～1178 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰歸屬于H2biim分子的特征伸縮振動；1093～1091，966～964，914～910和806～798 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰分別歸屬于多酸陰離子中v（P—Oa），v（W—Od），v（W—Oc—W）和v（W—Ob—W）的伸縮振動（Oa，Od，Oc/Ob分別表示四面體氧、端氧和橋氧）［26］.從以上IR譜圖及分析結(jié)果可知，化合物1～5均具有POM的4個特征峰，表明其具有相同的POM陰離子，即Dawson型POM陰離子.

Fig.3 FTIR spectra of compounds 1—5(A—E)

Fig.4 TG-DTA curves of compounds 1—5(A—E)

2.2.2 熱重分析圖4為化合物1～5的TG-DTA曲線.從圖4（A）可以看出，化合物1在30～800℃的溫度范圍內(nèi)存在兩步失重，分別對應失去2個結(jié)晶H2O分子和16個H2biim分子，總失重為20.7%（理論值19.5%）.化合物2也有兩步失重［圖4（B）］，分別對應失去8個結(jié)晶H2O分子和6個H2biim分子，總失重為16.7%（理論值為17.7%）.化合物3在30～800℃范圍內(nèi)分別失去6個H2biim分子和4個結(jié)晶H2O分子，總失重為16.2%（理論值為16.2%）［圖4（C）］.圖4（D）顯示化合物4在30～800℃范圍內(nèi)總失重為17.3%，兩步失重分別對應失去9個結(jié)晶H2O分子和6個H2biim分子（理論值為17.9%）.化合物5在30～800℃范圍內(nèi)分別失去9個H2biim分子和2個結(jié)晶H2O分子，總失重為21.6%（理論值為21.7%）［圖4（E）］.從DTA曲線可以看出，化合物1～5在429～636℃范圍內(nèi)均有明顯的放熱峰，這歸因于H2biim分子的燃燒［27］.以上結(jié)果表明，當溫度低于800℃時，多酸骨架仍然保持，說明化合物1～5具有良好的熱穩(wěn)定性.

2.3 酶固定化的影響因素

pH值、酶濃度和固定時間等是影響酶固定化效率的重要因素，而載體的穩(wěn)定性也是關鍵因素之一.為了評估POM基雜化化合物1～5的穩(wěn)定性，將它們分別浸泡于不同pH值（3.5～8.5）的PBS中，12 h后離心分離并測定化合物的IR光譜.從圖5可以看出，所有化合物在PBS中浸泡后仍能觀察到明顯的特征峰，表明化合物1～5在pH=3.5～8.5的PBS中具有良好的穩(wěn)定性，可以作為載體固定HRP.從圖6可以看出，化合物1～5在固定HRP前后IR特征峰位基本吻合，說明POM載體在酶固定化過程中主體結(jié)構沒有發(fā)生改變，顯示出良好的穩(wěn)定性.

Fig.5 FTIR spectra of compounds 1—5(A—E)before and after soaking in PBS at pH=3.5—8.5 for 12 h

Fig.6 FTIR spectra of compounds 1—5(A—E)before and after enzyme immobilization

隨后研究了pH值對HRP負載量(Q,mg/g)和固定化HRP活性的影響.Q由下式計算得出［28］：

Fig.7 HRP loading and TOF change curves with pH(A,D,G,J,M),effect of HRP concentration on the HRP loading(B,E,H,K,N),and effect of immobilization time on the HRP loading(C,F,I,L,O)Supports:compound 1(A—C);compound 2(D—F);compound 3(G—I);compound 4(J—L);compound 5(M—O).

式中：c0和c（mg/mL）分別是固定前后HRP的濃度，可利用標準曲線獲得；V（mL）為HRP溶液的體積；Ws（g）為POM化合物的質(zhì)量.在pH=3.5～8.5范圍內(nèi)，HRP在化合物1上的負載量隨著pH值增加呈現(xiàn)波動性變化［圖7（A）曲線a］；HRP/1的轉(zhuǎn)換頻率（TOF）值隨著pH的增加而增加，在pH=7.5時達到最大值，而后急劇減?。╬H=8.5）［圖7（A）曲線b］.因此，綜合考慮酶負載量和固定化酶活性，HRP固定在化合物1上的最適pH值為7.5.

在pH=7.5時進一步研究了HRP濃度和固定時間對化合物1固載HRP的影響［圖7（B）和（C）］.當HRP濃度和固定時間分別為1.0 mg/mL［圖7（B）］和240 min［圖7（C）］時，酶負載量接近最大值.基于以上實驗結(jié)果，化合物1固載HRP的最佳實驗條件如下：HRP濃度1.0 mg/mL；pH=7.5；固定時間240 min.HRP最大負載量為91.7 mg/g.對于化合物2～5，按照上述方法，同樣研究了pH，HRP濃度和固定時間對HRP負載量和固定化HRP活性的影響［圖7（D）～（O）］.化合物2～5固載HRP的最適pH、HRP濃度、固定時間以及HRP負載量Q分別為：5.5，1.5 mg/mL，220 min和122.7 mg/g；4.5，2.5 mg/mL，180 min和241.3 mg/g；4.5，2.5 mg/mL，200 min和225.3 mg/g；5.5，2.5 mg/mL，200 min和229.0 mg/g.上述結(jié)果顯示化合物1～5對HRP的負載量均很高，表明二者之間存在很強的吸附作用.

研究表明，HRP與載體之間的吸附作用是由多種作用力決定的［12，14，29］.為了確定POM化合物與HRP之間存在靜電相互作用，通過Zeta電位分析了化合物1和游離HRP的表面電位.在pH=7.5時，化合物1的表面電位為-22 mV，而游離HRP表面則帶正電（表面電位為5 mV），證明表面帶有大量負電荷的化合物1易與表面帶正電荷的HRP形成靜電相互作用.同時，含N修飾基團的引入不僅使化合物分子內(nèi)形成了大量的氫鍵，同時也易與HRP產(chǎn)生氫鍵作用［30］.以上結(jié)果表明，本文合成的POM基雜化化合物可通過多種非鍵作用將酶穩(wěn)定地固定在其表面.

2.4 固定化酶的表征

HRP可以通過簡單的物理吸附直接固定在化合物1～5上，但與載體相比HRP的含量少，很難確定HRP的存在，因此采用熒光標記法檢測所得固定化酶中的HRP［31］.用RhBTC標記HRP（RhBTC-HRP）后，按照1.4節(jié)實驗方法進行標記酶的固定化，并通過LSCM對固定化標記酶RhBTC-HRP/1～RhBTCHRP/5進行檢測（圖8）.從圖8可以清楚地觀察到紅色發(fā)光點，證實HRP已負載在化合物1～5上.為了研究固定化后酶的結(jié)構是否發(fā)生改變，比較了游離HRP和從載體（化合物1～5）上洗脫的HRP的CD譜.如圖9所示，解吸的HRP與游離HRP的CD曲線吻合良好，表明固定化后HRP的二級結(jié)構未發(fā)生改變，同時也說明5個POM化合物具有良好的生物相容性，能夠最大程度地保留HRP的活性.

Fig.8 LSCM images of RhBTC-labeled HRP/1—HRP/5(A—E)λex=543 nm.

Fig.9 CD spectra of desorbed HRP(a)from immobilized enzymes HRP/1—HRP/5(A—E)and free HRP(b)

2.5 固定化酶的重復使用性和儲存穩(wěn)定性

相比于游離HRP，固定化酶HRP/1～HRP/5易于從反應系統(tǒng)中分離出來并實現(xiàn)重復使用.以固定化酶第一輪反應的TOF值為基準，計算其重復使用后的相對活性.如圖10所示，5例固定化酶均能實現(xiàn)重復使用，連續(xù)使用9次后仍能保留50%以上的活性，表明HRP/1～HRP/5具有良好的可重用性.固定化酶活性的下降可能是由于反復洗滌或長時間暴露于高濃度底物中造成了HRP溶脫或失活［32］.

Fig.10 Relative activity of HRP/1—HRP/5(A—E)after repeated uses

在室溫下保存1～12 d后，利用Worthington方法研究游離HRP和HRP/1～HRP/5的儲存穩(wěn)定性（圖11）.以第一天測得的固定化酶TOF值為基準，計算其存儲后的相對活性.由圖11可見，12 d后游離HRP活性顯著下降至20%以下，而固定化酶在相同的儲存條件下相對活性仍保持在70%以上，證明固定在這類POM載體上后，HRP的儲存穩(wěn)定性明顯提高.即，與游離HRP相比，固定化HRP更穩(wěn)定，更不易受到環(huán)境因素的影響.

Fig.11 Relative activity of HRP/1—HRP/5 and free enzyme during storage at 25℃for 12 d

2.6 過氧化氫檢測

4-APP與苯酚反應的紅色產(chǎn)物的吸光度與H2O2的用量成正比，因此，Worthington方法可用于H2O2檢測.從圖12可以看出，當H2O2濃度增加時，在一定濃度范圍內(nèi)510 nm處吸光度的變化值與H2O2濃度呈線性關系.固定化酶HRP/1-HRP/5檢測H2O2的線性范圍分別為0.04～0.35，0.04～0.26，0.04～0.52，0.04～0.44，0.04～0.44 mmol/L；H2O2的檢出限分別為1.49，1.35，2.58，5.75，4.09 μmol/L.其中化合物1和2的檢出限甚至與電荷更高的Preyssler型POM基材料接近（1.61和1.49 μmol/L）［14］.

Fig.12 Linear standard curve for HRP/1—HRP/5(A—E)to detect H2O2ΔA510 nm=A（immobilized HRP，510 nm）－A（blank，510 nm）.

3 結(jié)論

TM和H2biim的引入增強了傳統(tǒng)POM的性能，使5種新的Dawson型有機-無機雜化化合物具有新的應用.該類Dawson型POM和TM-H2biim組成的有機-無機雜化化合物被用作HRP固定化的載體，固定化酶HRP/1—HRP/5具有較高的穩(wěn)定性和催化活性，可以開發(fā)一種用于檢測痕量H2O2的比色系統(tǒng).本工作表明，基于POM的不溶性材料可能是一種優(yōu)秀的酶固定化載體并可應用于酶催化反應.