王方圓，張奮嫻，李毅，高建華，牛顏冰，申少斐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太谷 030801）

近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)越來(lái)越成熟［1～5］，由于其具有分析速度快、成本低和通量高等特點(diǎn)，已成為前沿技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域.微流控芯片更易模擬體內(nèi)的生理環(huán)境［6～9］，在自然環(huán)境中，樹(shù)葉的脈序在尺寸［10，11］、形態(tài)［12～14］和功能［15～17］等方面與人體內(nèi)的血管組織類似，用樹(shù)葉脈序制得的微流控芯片對(duì)研究細(xì)胞或細(xì)菌行為具有重要意義［18］.

使用自然環(huán)境中的樹(shù)葉會(huì)受到季節(jié)的限制，若在樹(shù)葉掉落之前沒(méi)有完成實(shí)驗(yàn)，則實(shí)驗(yàn)的后續(xù)操作會(huì)受到阻礙.且每片樹(shù)葉脈序的形狀都不一致，制作出來(lái)的微流控芯片通道也會(huì)因樹(shù)葉的不同而改變.因此，制備出仿生樹(shù)葉模型具有重要意義，不僅可以解決上述問(wèn)題，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，還為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障.目前，已有將微流控芯片仿生樹(shù)葉模型用于生物分析方面的研究報(bào)道［12～16］.Wu等［12，13］采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）構(gòu)建了樹(shù)葉型微流控通道，對(duì)其生物相容性進(jìn)行了研究；Mao等［14，15］利用光刻模具制作出PDMS芯片模擬了血管系統(tǒng).然而，目前仿生樹(shù)葉模型大多集中在PDMS芯片研究，利用仿生模型構(gòu)建簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易操作的瓊脂糖微流控芯片鮮見(jiàn)報(bào)道.

本文利用仿生樹(shù)葉模板制作的瓊脂糖微流控芯片對(duì)大腸桿菌的趨化性進(jìn)行了研究.建立一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)脈序，最大脈序尺寸值可達(dá)1038.02 μm，最小脈序尺寸為36.32 μm，寬度不一的通道構(gòu)建為細(xì)菌趨化性實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定可靠的梯度空間.此外，構(gòu)建瓊脂糖微流控芯片具有巨大優(yōu)勢(shì).由于瓊脂糖通道具有毛細(xì)力，瓊脂糖具有親水性，不需要借助外力就可以讓細(xì)菌順利地進(jìn)入瓊脂糖微流控芯片，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌趨化性的定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，可以更好地對(duì)細(xì)菌生存的微環(huán)境進(jìn)行控制.瓊脂糖微流控芯片相較于PDMS微流控芯片顯著降低了微流控芯片的制作成本，提高了效率，可以在不傷害動(dòng)物體、對(duì)環(huán)境無(wú)害的前提下，快速準(zhǔn)確地進(jìn)行藥物機(jī)理、藥物作用途徑等方面的研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

新鮮桑樹(shù)葉；75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液，河北康濟(jì)藥械有限公司；RTV615型聚二甲基硅氧烷（PDMS，A膠）和RTV615型PDMS固化劑（B膠），美國(guó)Momentive公司；三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；瓊脂，B.R.級(jí)，北京索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物，B.R.級(jí)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

2X2-2 型真空泵和DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KW-4型勻膠機(jī)（中國(guó)科學(xué)院微電子中心研究部）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 仿生樹(shù)葉模型陰膜的制作將采摘的新鮮樹(shù)葉置于75%乙醇溶液中煮沸進(jìn)行消毒處理，取出后用濾紙擦干；按m（A膠）∶m（B膠）=10∶1的比例混合制得PDMS聚合物；將樹(shù)葉背面作為陽(yáng)模，首先將雙面膠粘在玻璃板上，然后將樹(shù)葉正面貼在雙面膠帶上，在陽(yáng)模表面覆蓋一層PDMS聚合物［12，13，16］，置于真空干燥箱中抽真空完全除氣泡20 min，排出氣泡，確?；旌先芤涸诿荛]環(huán)境下聚合形成水凝膠，之后于恒溫恒濕條件干燥，于80℃固化45 min，最后將已經(jīng)固化的仿生樹(shù)葉模型陰模從樹(shù)葉表面撕掉，得到仿生樹(shù)葉模型陰模結(jié)構(gòu).

1.2.2 仿生樹(shù)葉模型的制作將1.2.1節(jié)制作的仿生樹(shù)葉模型陰模用雙面膠貼在培養(yǎng)皿的內(nèi)部上方，并在陰模的正下方用培養(yǎng)皿承載5滴修飾液體［三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷］，密封培養(yǎng)皿，以上操作均在通風(fēng)櫥內(nèi)完成，并在通風(fēng)櫥內(nèi)靜置5 h，待修飾液完全自然蒸發(fā)，從而在仿生樹(shù)葉模型陰模的表面形成一層隔離層；打開(kāi)培養(yǎng)皿，取下陰模，再次倒入PDMS聚合物，抽真空完全除氣泡20 min后，放入80℃的恒溫箱內(nèi)12 h.修飾物的存在使得前后兩次加入的PDMS相互隔離，有一道明顯的隔離層，揭下即得到仿生樹(shù)葉模型結(jié)構(gòu)（圖1）.

1.2.3 PDMS芯片的制作將按m（A膠）∶m（B膠）=20∶1比例混合的PDMS聚合物倒在玻璃板上，置于勻膠機(jī)中覆蓋均勻，放入80℃烘箱3～5 min后取出，與仿生樹(shù)葉模型陰模結(jié)構(gòu)結(jié)合，使仿生樹(shù)葉模型陰模與玻璃板緊緊鍵合，即得到PDMS芯片.

1.2.4 瓊脂糖芯片的制作圖2為微流體芯片設(shè)計(jì)圖，芯片主要由加工有微流體通道的瓊脂糖薄層和玻璃基底組成.將融化的瓊脂糖倒在PDMS仿生樹(shù)葉模型陽(yáng)模上，待冷卻凝固后，在揭起瓊脂糖芯片前將通道開(kāi)口陣列切開(kāi)［19］；將清洗干凈的瓊脂糖芯片和玻璃基底緊密貼合.

Fig.1 Production process of bionic leaf modela.Natural leaves are pasted on double-sided tape；b.PDMS prepolymer is poured into the glass plate；c.PDMS replica is stripped after curing；d.PDMS is decorated；e.PDMS prepolymer is poured into the culture plate；f.PDMS replica is stripped after curing.

Fig.2 Production process of agarose chipa.Agar is poured;b.PDMS replica stripped after curing;c.the channel opening array is cut;d.agar replicates are bonded to the substrate.

1.2.5 菌液樣品的制備在超凈工作臺(tái)中吸取少量菌液加入含液體LB培養(yǎng)基（含氨芐）的EP管中，混合均勻后，再抽取少量菌液均勻地涂布于固體LB培養(yǎng)基（含氨芐）平板上.然后，將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，在超凈工作臺(tái)中挑選單菌落，將單菌落放入含LB培養(yǎng)基（含氨芐）的EP管中.將挑完單克隆的菌液放入37℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3～4 h后，取出放入4℃冰箱中貯存待用.實(shí)驗(yàn)前，在超凈工作臺(tái)中取儲(chǔ)存在EP管中的菌液到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，再振蕩培養(yǎng)20 h待用.GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌（E.coli）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院高建華副教授提供.

1.2.6 大腸桿菌趨化性觀察用瓊脂糖微流控芯片培養(yǎng)并觀察大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)狀況.將細(xì)菌懸液樣品加樣于瓊脂糖微流控芯片的入口處.由于毛細(xì)現(xiàn)象［19］，細(xì)菌懸液樣品會(huì)被動(dòng)地流入微通道內(nèi).為對(duì)大腸桿菌的趨化性進(jìn)行觀察，可在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)在入口處分別滴加PBS緩沖液和含氨芐的LB培養(yǎng)基.

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片材質(zhì)的選擇

制作了PDMS微流控芯片和瓊脂糖微流控芯片.通過(guò)對(duì)比2種材質(zhì)芯片的效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖微流控芯片.原因如下：（1）由于用PDMS制作的仿生樹(shù)葉模型尺寸較大，陰模結(jié)構(gòu)靠近中心位置和其它邊緣位置的承重力存在差異，導(dǎo)致陰模結(jié)構(gòu)與玻璃基底上的PDMS聚合物鍵合在一起時(shí)，容易出現(xiàn)貼合不均勻的現(xiàn)象，進(jìn)而在自身重力作用下出現(xiàn)管道塌陷，如圖3所示；而瓊脂糖芯片只與玻璃基底結(jié)合，無(wú)其它物質(zhì)堵塞通道結(jié)構(gòu)，且通過(guò)后續(xù)用染料和熒光顯微鏡下的觀察驗(yàn)證了各通道結(jié)構(gòu)均正常存在.（2）PDMS的成本遠(yuǎn)高于瓊脂.（3）PDMS微流控芯片的制作時(shí)間要比瓊脂糖微流控芯片長(zhǎng)很多.瓊脂糖微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌趨化性的定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，可以更好地對(duì)細(xì)菌生存的微環(huán)境進(jìn)行控制［20］.綜上所述，最終實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖微流控芯片.

Fig.3 PDMS microfluidic chip

2.2 瓊脂糖微流控芯片通道結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證

瓊脂糖是親水性物質(zhì)，所以樣品中的水分可以透過(guò)瓊脂糖層，利用這一性質(zhì)可以驗(yàn)證用仿生樹(shù)葉模型制作出來(lái)的瓊脂糖微流控芯片各結(jié)構(gòu)通道是否正常存在.將用乙醇制備的藍(lán)色染料滴加在瓊脂糖微流控芯片的入口處，幾秒鐘之內(nèi)藍(lán)色染料分布于整個(gè)結(jié)構(gòu)中，顯現(xiàn)出一個(gè)完整樹(shù)葉形狀，如圖4所示，表明制得的瓊脂糖微流控芯片各結(jié)構(gòu)通道都正常存在.

Fig.4 Dyed agarose microfluidic chip

Fig.5 Schematic diagram of mulberry leaves and their pulse sequence

植物葉脈指的是葉片表面可見(jiàn)的紋絡(luò)，主要由貫穿在葉片內(nèi)部的維管組織及其周?chē)谋”诮M織、厚壁組織和厚角組織等組成，葉脈通過(guò)葉柄與莖內(nèi)的維管組織相連，起輸導(dǎo)和支持作用［21］.葉脈在葉片上呈現(xiàn)出各種有規(guī)律的脈紋分布，稱為脈序.脈序可分為3類：平行脈、網(wǎng)狀脈和叉狀脈.本文中后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要采用桑葉，但對(duì)叉狀脈的銀杏葉，平行脈的車(chē)前子葉、玉蘭葉，網(wǎng)狀脈的桑樹(shù)葉，毛泡桐葉都進(jìn)行了制作，均可做出仿生樹(shù)葉模板.本實(shí)驗(yàn)用到所有葉片主要為網(wǎng)狀脈，網(wǎng)狀脈序作為水分的運(yùn)輸通道，能夠?yàn)槿~肉細(xì)胞提供持續(xù)穩(wěn)定的水分供給［22～25］，這是因?yàn)榫W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為水分輸送提供了多條路徑［26，27］.脈序又分為一級(jí)脈序、二級(jí)脈序和三級(jí)脈（圖5）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文所構(gòu)建的仿生瓊脂糖微流控芯片具有以上3種脈序.

Fig.6 Distributions of Escherichia coli in various channel structures

此外，將大腸桿菌菌液注入瓊脂糖微流控芯片中，在熒光倒置顯微鏡下觀察了各通道結(jié)構(gòu)（圖6）.并對(duì)所構(gòu)建的仿生模型通道尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，一級(jí)脈序1條，尺寸最大值為1038.02 μm；二級(jí)脈序8條，尺寸最大值為335.07 μm，尺寸最小值為97.08 μm，大部分二級(jí)脈序的尺寸在200～280 μm之間；三級(jí)脈序76條，尺寸最大值為114.88 μm，尺寸最小值為36.32 μm，大部分三級(jí)脈序的尺寸在50～100 μm之間.所構(gòu)建的仿生模型通道寬度不一，更接近于人體的真實(shí)環(huán)境，大腸桿菌能夠順利進(jìn)入各級(jí)脈序，產(chǎn)生梯度的分布.這些現(xiàn)象證明已構(gòu)建出仿生樹(shù)葉的瓊脂糖微流控芯片，為后續(xù)研究大腸桿菌的趨化性奠定了基礎(chǔ).

2.3 大腸桿菌的趨化性

在自然環(huán)境中，適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所都有一定的離子濃度和營(yíng)養(yǎng)成分，細(xì)菌能夠感受周?chē)h(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，并沿著化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度定向運(yùn)動(dòng)，這種性質(zhì)稱為趨化性［28］.為驗(yàn)證所構(gòu)建的仿生樹(shù)葉模型制作出的瓊脂糖微流控芯片可以用于研究大腸桿菌的趨利性，設(shè)置了蒸餾水和培養(yǎng)液兩種不同生存環(huán)境的對(duì)照組.因芯片中的各結(jié)構(gòu)通道高度、寬度不一，所以當(dāng)把菌液滴在入口處時(shí)會(huì)出現(xiàn)毛細(xì)現(xiàn)象，將菌液吸入.由于毛細(xì)現(xiàn)象，所用大腸桿菌分布于各通道中，會(huì)優(yōu)先向生存空間充足的地方移動(dòng)，即菌液會(huì)即刻把一級(jí)脈序、二級(jí)脈序充滿，之后再?gòu)亩?jí)脈序緩慢地移向三級(jí)脈序.芯片的入口只有一級(jí)脈序，細(xì)菌樣品首先接觸到一級(jí)脈序，接著在毛細(xì)現(xiàn)象的作用下逐漸接觸到其它脈序.從視頻S1（見(jiàn)本文支持信息）可以看出，若在入口處滴加幾滴PBS緩沖溶液，毛細(xì)現(xiàn)象會(huì)使PBS緩沖溶液被吸入通道中，PBS緩沖溶液與菌液之間具有一段空結(jié)構(gòu)通道，形成一段壓力柱，大腸桿菌會(huì)加快向原方向移動(dòng)速度，且一段時(shí)間后也并未向入口處移動(dòng)［圖7（A）和（B）］.

Fig.7 Movement of bacterial solution away from the inlet every 5 s in the channel structures after adding bacterial solution(A)or PBS solution(B)at the inlet and the movement of bacterial solution near the inlet every 5 s in the structural channel after adding the culture solution at the inlet(C)

圖7（C）所示為相同條件下，把菌液（1.5×108個(gè)/mL）滴在入口處，所用大腸桿菌分布于各通道中，此時(shí)在入口處滴加一滴含氨芐的LB培養(yǎng)液，大腸桿菌則會(huì)向相反方向移動(dòng)，即向滴加培養(yǎng)液的入口處方向移動(dòng)，視頻S2（見(jiàn)本文支持信息）可以印證這一現(xiàn)象.對(duì)各種溶液進(jìn)入芯片后的移動(dòng)距離進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，若規(guī)定遠(yuǎn)離入口處的方向?yàn)檎颍尤刖汉?5 s正向移動(dòng)了6.95×102μm，加入PBS緩沖溶液后15 s正向移動(dòng)了7.03×102μm，加入營(yíng)養(yǎng)液后15 s反向移動(dòng)了1.39×103μm.以上結(jié)果說(shuō)明，在周?chē)瞽h(huán)境所提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相同時(shí)，大腸桿菌會(huì)順著所受外界力的方向移動(dòng)，但是如果有更好的生活環(huán)境，大腸桿菌受到的外界力會(huì)遠(yuǎn)小于大腸桿菌向更好生活環(huán)境移動(dòng)的力.大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)性包括游動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)，它們受鞭毛的逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)和順時(shí)針旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)，通常使用復(fù)雜的趨化信號(hào)系統(tǒng)來(lái)指導(dǎo)它們的運(yùn)動(dòng).相關(guān)蛋白協(xié)調(diào)合作，相互影響，感知環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)濃度的變化，并將這些化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，控制相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而控制鞭毛運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)大腸桿菌向更好的生活環(huán)境移動(dòng).

3 結(jié)論

利用PDMS和三氯硅烷的特性制作了仿生樹(shù)葉模板，并進(jìn)一步構(gòu)建了可進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和觀察的瓊脂糖微流控芯片.仿生樹(shù)葉模板的制作使實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行不受季節(jié)限制，可節(jié)約成本，保護(hù)環(huán)境.最重要的是由于脈序的高度、寬度、長(zhǎng)度不一，為細(xì)菌趨化性實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定可靠的梯度空間，對(duì)探索藥物篩選、微生物利害等研究具有重要意義.此外，瓊脂糖微流控芯片平臺(tái)的建立有利于對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)和觀察，植物和動(dòng)物的內(nèi)部運(yùn)輸通道雖然大相徑庭，但是在血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面非常相似，在一定程度上可以模擬血管的相關(guān)生理學(xué)特性，用于研究多種血細(xì)胞相互作用的機(jī)制和多種藥物對(duì)心肌細(xì)胞影響等.

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