王柏輝，周晉堯，周霞，孫亞婷，薛彥倫，呂樹梅

1. 鄂爾多斯市檢驗(yàn)檢測(cè)中心（鄂爾多斯 017000）；2. 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院（鄂爾多斯 017000）

根據(jù)《中國(guó)居民膳食指南》要求，肉及肉制品是日常飲食中必不可少的一部分，每人每天應(yīng)攝入100 g左右的肉制品。肉制品中蛋白質(zhì)含量約占20%，同時(shí)畜肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如亞油酸、維生素、礦物元素等比較豐富[1]。伴隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的高質(zhì)量發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)肉及肉制品的需求越來越多樣化，對(duì)肉制品的感官質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)愈加重視，而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，近年來肉制品摻假摻雜事件頻頻發(fā)生[2]。2013年歐洲的“馬肉風(fēng)波”事件和2016年大潤(rùn)發(fā)肉類摻假事件揭示商家以廉價(jià)肉代替高價(jià)肉售賣，以牟取暴利。肉制品的摻假主要體現(xiàn)在：原料肉的摻假；肌肉組織替換，如用動(dòng)物脂肪組織替換肌肉組織；添加植物蛋白等。

針對(duì)肉制品安全性監(jiān)管和保護(hù)消費(fèi)者利益，全球各個(gè)國(guó)家食品安全部門對(duì)肉及肉制品生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者具有明確的法律法規(guī)約束，但也需要借助科學(xué)技術(shù)手段以保障食品安全。常見的肉制品真實(shí)性鑒別方法包括分子生物學(xué)技術(shù)、振動(dòng)光譜技術(shù)、質(zhì)譜和色譜技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)。肉制品真實(shí)性鑒別技術(shù)是監(jiān)管肉制品摻假摻雜和維護(hù)市場(chǎng)安全流通的有效保障，同時(shí)肉制品摻假摻雜形式的多樣化決定了鑒別技術(shù)的準(zhǔn)確性和多樣性，如何提升肉制品鑒別技術(shù)的準(zhǔn)確性和便利性以及擴(kuò)大鑒別技術(shù)的應(yīng)用范圍是目前保障肉制品安全的發(fā)展方向。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)已成為肉及肉制品真實(shí)性分析領(lǐng)域的常規(guī)工具，允許在復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)不同物種進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別。DNA是生物體細(xì)胞中主要遺傳物質(zhì)，在不同物種中具有較高的保守性。生物體細(xì)胞中DNA具有耐熱性和穩(wěn)定性的特性，被廣泛用于肉制品摻假摻雜檢測(cè)中[3]。分子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、基因芯片、DNA條形碼和電化學(xué)DNA傳感器。

1.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是針對(duì)指定的DNA序列設(shè)計(jì)引物，利用DNA聚合酶在體外循環(huán)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA快速擴(kuò)增。PCR技術(shù)因具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、反應(yīng)效率高且成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，已成為肉制品真實(shí)性鑒別的常用技術(shù)方法。應(yīng)用在肉及肉制品真?zhèn)螜z測(cè)的PCR技術(shù)主要包括多重PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。

多重PCR技術(shù)是基于在同一PCR反應(yīng)體系當(dāng)中加入2對(duì)及以上的引物，對(duì)單一樣本同時(shí)準(zhǔn)確擴(kuò)增多個(gè)核酸片段，進(jìn)而完成對(duì)多個(gè)肉類品種的準(zhǔn)確分析。Prusakova等[4]基于8個(gè)物種線粒體ATPase基因序列間的差異，設(shè)計(jì)特征引物，引物對(duì)于不同的DNA來源沒有交叉反應(yīng)。用建立的多重PCR技術(shù)鑒別牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、火雞肉、貓肉、狗肉和老鼠肉，該方法可以同時(shí)精準(zhǔn)鑒別8種肉類，靈敏度能達(dá)到30 pg DNA。Ali等[5]基于ND5、ATPase6和CytB基因設(shè)計(jì)5對(duì)引物，利用多重PCR技術(shù)可同時(shí)鑒別5種動(dòng)物（貓、狗、豬、猴和鼠），該方法的靈敏度在0.01～0.02 ng DNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR體系中加入染料或者探針等熒光基團(tuán)，通過熒光信號(hào)強(qiáng)度變化實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)中DNA濃度的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉及肉制品進(jìn)行鑒別，通過DNA的濃度和CT值間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)定量。Wang等[6]建立利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)鑒別山羊肉中豬肉的方法，豬肉添加量在5%～80%之間，山羊肉和豬肉的比值與CT值間的線性條件較好。同時(shí)，Xu等[7]建立實(shí)時(shí)定量多重PCR技術(shù)鑒別不同肉源（鴨肉、豬肉、雞肉和牛肉），該方法效果較好，準(zhǔn)確度約98%，單個(gè)物種的靈敏度為0.01%。

微滴數(shù)字PCR是近年來迅速發(fā)展的一種核酸精準(zhǔn)定量技術(shù)，通過將模板大量稀釋到單個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行目標(biāo)分子的PCR擴(kuò)增，根據(jù)熒光信號(hào)，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)量計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是直接完成DNA的絕對(duì)定量，而不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。Chen等[8]應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)分別建立牛肉及其制品中豬肉和鴨肉的含量檢測(cè)的方法，該方法樣品中DNA濃度的最低檢出限和最低定量限分別為0.001%和0.01%，并應(yīng)用該方法對(duì)市場(chǎng)樣品檢測(cè)，效果良好。Cao等[9]基于細(xì)胞色素B基因（cytB基因）應(yīng)用微滴數(shù)字PCR法建立鯧魚物種鑒定和定量的方法，該方法的絕對(duì)檢測(cè)限和定量限分別為2拷貝/mL和21拷貝/mL。

1.2 DNA條形碼技術(shù)

針對(duì)未知樣品檢測(cè)，DNA條形碼技術(shù)是近年來興起的用于肉類真?zhèn)舞b定的新型技術(shù)。該技術(shù)其原理就是依靠標(biāo)準(zhǔn)、能夠變異、容易擴(kuò)增并且相對(duì)較短的DNA片段，該片段在物種內(nèi)具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確識(shí)別和未知物種鑒定，類似于商店的商品標(biāo)簽碼。勵(lì)炯等[10]基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因（COI基因）的DNA微條形碼技術(shù)建立牛羊肉制品中6種廉價(jià)肉的摻假鑒定方法，所有肉類的擴(kuò)增效率都為100%，廉價(jià)肉的檢出限都在10%以內(nèi)，該方法靈敏度合適，前處理簡(jiǎn)單，可用于高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熟肉制品中摻雜摻假鑒定。Cottenet等[11]利用高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建復(fù)雜樣品的多物種DNA條形碼鑒別技術(shù)，成功分析46種純?nèi)忸惡突旌先忸愇锓N，包括一些近緣物種，如野牛與牛肉。此外，該方法也適用于加工肉制品的鑒定。

2 光譜技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

近年來光譜技術(shù)逐漸被應(yīng)用于食品安全分析，是無損檢測(cè)的重要技術(shù)之一。光譜技術(shù)應(yīng)用原理是在不同波長(zhǎng)下肉及肉制品中一些基本營(yíng)養(yǎng)成分如水分、脂肪、蛋白質(zhì)、脂肪酸或氨基酸等小分子化合物產(chǎn)生光譜不同。該技術(shù)具有前處理方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快和不破壞樣品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。光譜技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性檢測(cè)方面，主要有紅外光譜法、拉曼光譜技術(shù)和高光譜成像技術(shù)。

紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）是指頻率在780～25 000 μm之間的電磁波，能引起分子中振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，不同物質(zhì)通過檢測(cè)分析紅外線被吸收情況而得到的紅外光譜。近紅外光譜法和中紅外光譜被廣泛應(yīng)用于肉制品摻雜摻假的檢測(cè)控制。Leng等[12]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）建立牛肉制品中豬肉和鴨肉成分鑒別方法，結(jié)果表明，判別分析模型能夠區(qū)分牛肉與豬肉和鴨肉的比率分別為100%和91.5%，而PLSR模型區(qū)分牛肉與豬肉和鴨肉的比率95.80%和95.69%。MAbood等[13]利用傅里葉近紅外光譜對(duì)38種肉源中豬肉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，基于PCA分析和PLS-DA都能夠快速準(zhǔn)確地區(qū)分豬肉與其他肉類，且所建立的PLSR模型對(duì)摻假鑒別準(zhǔn)確率為97.74%。另外，國(guó)外研究者采用中紅外光譜結(jié)合PLS-Kernel預(yù)測(cè)模型分析建立牛肉及其制品中豬肉的鑒別方法，該方法的豬肉最低檢出限為1.4%，該方法的應(yīng)用對(duì)于清真食品安全管理具有廣闊的前景[14]。

拉曼光譜（Raman spectra，RS）是由物質(zhì)分子對(duì)光源的散射產(chǎn)生的一種非破壞性的指紋成像技術(shù)。拉曼光譜與入射光強(qiáng)度無關(guān)，與樣品組成物質(zhì)本身的極化率有關(guān)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)實(shí)現(xiàn)肉制品摻假鑒別。Nunes等[15]基于功能性成分氨基酸、脂肪和蛋白質(zhì)建立RS結(jié)合PLS-DA的模型，可以準(zhǔn)確分析出豬肉產(chǎn)品中的非肉類成分卡拉膠，該方法效果顯著。Al-Sarayreh等[16]利用拉曼光譜建立不同動(dòng)物油脂（牛油、豬油、雞油和鴨油）的鑒別方法，在牛油中從0～50%添加豬油和鴨油進(jìn)行檢測(cè)，表明該方法線性條件較好。

高光譜成像光譜技術(shù)（Hyperspectral imaging spectroscopy，HIS）是將光譜技術(shù)與圖像處理技術(shù)相結(jié)合，可以同時(shí)獲得光譜分辨率和空間分辨率，快速高效的獲得光譜數(shù)據(jù)信息和空間信息。由于快速、無損和無復(fù)雜的前處理等優(yōu)點(diǎn)，被用于肉制品摻雜摻假的鑒定研究中。Zhang等[17]利用高光譜成像收集不同狀態(tài)的羊肉、牛肉和豬肉肌肉的掃描圖像數(shù)據(jù)集，并使用深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）模型提取光譜和空間特征，對(duì)紅肉制品摻假進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，CNN模型在不依賴于產(chǎn)品狀態(tài)的情況下，總體分類準(zhǔn)確率達(dá)到94.4%，可以作為快速、可靠、無損檢測(cè)紅肉制品摻假的有力工具。Jiang等[18]基于高光譜成像技術(shù)研究肉餡中內(nèi)臟摻雜摻假情況，通過對(duì)180個(gè)摻假樣品分析，建立PLSR模型，該模型的預(yù)測(cè)系數(shù)為98%，誤差為4.25%。

3 色譜、質(zhì)譜技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

色譜、質(zhì)譜技術(shù)是定性和定量肉及肉制品中蛋白質(zhì)和多肽的基本常用工具，色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合可精準(zhǔn)分析復(fù)雜物質(zhì)的成分和含量，該技術(shù)具有檢測(cè)速度快，儀器靈敏度高，應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。色譜技術(shù)是基于蛋白質(zhì)和多肽的特性，選擇合適的流動(dòng)相在相應(yīng)的固定相進(jìn)行洗脫，不同物質(zhì)或成分以不同速度在固定相中移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。質(zhì)譜技術(shù)是利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路，基于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物多肽的離子質(zhì)荷比，得到每個(gè)肽段的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，依靠蛋白數(shù)據(jù)庫（Uniprot和NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行比對(duì)，尋找特異性多肽。因此，基于色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合使用可實(shí)現(xiàn)蛋白或多肽的鑒別。Wang等[19]基于LC-QTOF-MS技術(shù)從5種動(dòng)物肉源（牛、羊、豬、雞和鴨肉）中篩選出56個(gè)特征多肽，再通過LC-MS/MS對(duì)特征肽段的特異性進(jìn)行篩查，最終分別得到4，3，3，6和4條多肽片段被用于牛、羊、豬、雞和鴨肉的鑒別。Hu等[20]基于特征肽段GDSVAYGLK作為標(biāo)記物，利用UPLC-MS/MS技術(shù)建立測(cè)定水牛、牦牛、綿羊和山羊肉中骨橋蛋白含量的方法，該方法的測(cè)定結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。李瑩瑩等[21]利用LC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)羊肉中鴨肉摻假情況進(jìn)行研究，篩選出鴨肉的專屬多肽152條。利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)鴨肉特異性進(jìn)行篩查，最終確定10條鴨肉肽段作為定性離子的母離子，并通過不同比例添加模擬摻假樣品進(jìn)行定量研究，研究結(jié)果表明該方法的鴨肉的最低檢出限是0.5%。Stachniuk等[22]基于LC-QTOF-MS/MS技術(shù)在兔肉中篩選了區(qū)別于其他物種的49個(gè)熱穩(wěn)定性肽段，而在兔肉加工肉制品中只檢測(cè)到穩(wěn)定性強(qiáng)的3個(gè)肽段，分別為SSVFVADPK，AFFGHYLYEVAR和PHSHPALTPEQK，可被用于兔肉加工肉制品的鑒別分析。Fornal等[23]通過不同的食品加工方式，比如均質(zhì)化、蒸煮、烤制、干燥和殺菌處理后，篩選出雞、鴨和鵝肉中熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的特征肽段。利用LC-MS技術(shù)建立快速篩查加工肉制品中雞、鴨和鵝肉的鑒別方法，該方法可用于肉制品摻假和食品標(biāo)簽與成分相符檢測(cè)等食品安全監(jiān)管領(lǐng)域。

4 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是基于抗原和抗體的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)樣品的分析檢測(cè)。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的常用的技術(shù)手段，主要包括間接酶聯(lián)免疫分析和夾心酶聯(lián)免疫分析。酶聯(lián)免疫技術(shù)的工作原理是抗原或抗體吸附在固相載體表面，酶結(jié)合抗原或抗體后仍保持其酶活性與免疫活性，通過加入相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)底物顏色的變化來判斷免疫反應(yīng)的進(jìn)程。ELISA技術(shù)具有特異性強(qiáng)、成本低和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到肉及肉制品真實(shí)性的甄別。國(guó)外研究者開發(fā)一種夾心ELISA試劑盒能夠快速量化檢測(cè)在煮熟馬肉、豬肉、牛肉、雞肉和羊肉中豬肉的含量，該方法中蒸煮和高壓處理得到的熟制豬肉的檢出靈敏度分別為0.000 14%和0.000 4%，且定量分析范圍為0.05%～3.2%[24]。Kuswandi等[25]基于抗豬免疫球蛋白G抗體開發(fā)一種橫向流動(dòng)免疫傳感器用于牛肉加工制品中豬肉摻假檢測(cè)，該方法檢出限為0.01%，并與市售ELISA試劑盒比對(duì)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。Benli等[26]利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和PCR技術(shù)對(duì)60份商業(yè)牛肉發(fā)酵香腸中雞肉摻假現(xiàn)象進(jìn)行研究，結(jié)果表明，2種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致，5份樣品存在雞肉摻假情況。由于酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)對(duì)抗體的特異性要求高，且受到肉制品的加工方式等條件的影響較大，因此，需要其他技術(shù)手段的輔助檢測(cè)。

5 代謝組學(xué)技術(shù)在肉及肉制品真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

組學(xué)技術(shù)是較熱門的科學(xué)研究手段，其中代謝組學(xué)是以高通量檢測(cè)技術(shù)和多元數(shù)據(jù)分析為手段，通過研究機(jī)體代謝物（分子量＜1 500 Da）的差異變化，進(jìn)而探究代謝機(jī)制的新技術(shù)。在肉品科學(xué)領(lǐng)域隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷拓展和應(yīng)用，涉及肉品安全、肉品營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味和肉品加工等多個(gè)方面。代謝組學(xué)的基本原理是基于代謝圖譜分析和代謝標(biāo)志物的篩選來實(shí)現(xiàn)肉及肉制品安全性和真實(shí)性分析和鑒別。

根據(jù)肉及肉制品中代謝物的差異，代謝組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)牛肉、羊肉和豬肉的有效鑒定。Pavlidis等[27]利用頂空固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜法對(duì)牛肉中添加不同比例的豬肉進(jìn)行代謝物分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合樣品中2-丁醇和1-辛烯-3-醇是主要代謝物，同時(shí)建立一種基于揮發(fā)性指紋圖譜的鑒別方法，鑒別正確率達(dá)99%。同時(shí)，對(duì)牛肉和馬肉樣品中甘油三酯圖譜的差異研究表明，馬肉中含有較高比例的多不飽和脂肪酸，因此可根據(jù)脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果來判別牛肉中馬肉的摻假情況[28]。另外，孟新濤等[29]研究基于氣相離子遷移譜技術(shù)建立羊肉中豬肉和雞肉摻假鑒別的方法，結(jié)果表明羊肉中豬肉的添加比例大于5%時(shí)，正己醇、2, 3-丁二酮、羥基丙酮等39種主要風(fēng)味物質(zhì)的含量在增加，而2-乙基-1-己醇、芝麻酚、2-戊酮的含量在降低；羊肉中雞肉的添加比例大于10%時(shí)，混合物的主要風(fēng)味物質(zhì)正己醇、3-甲硫基丙醛、反-2-辛烯醛的含量在降低，而甲醛等風(fēng)味物質(zhì)在增加。

6 結(jié)語

肉及肉制品的摻假現(xiàn)象是畜肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展中存在的重要問題，所涉及的鑒別技術(shù)方法是近幾年應(yīng)用于肉及肉制品真實(shí)性鑒別的主要技術(shù)手段。分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高，對(duì)肉及肉制品摻假檢測(cè)應(yīng)用廣泛，但需要開發(fā)精準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法。光譜技術(shù)具有制樣簡(jiǎn)便、無損、綠色與高效等特點(diǎn)，但基于化學(xué)計(jì)量學(xué)所建立的模型預(yù)測(cè)效果受諸多外界條件的影響，通用性不強(qiáng)。ELISA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是易于操作，使用范圍廣泛，分析時(shí)間短、靈敏度和通量較高，但尋找一個(gè)熱穩(wěn)定的抗原和研制出針對(duì)此抗原的特異性單克隆抗體難度較大。組學(xué)技術(shù)是未來發(fā)展方向，基于質(zhì)譜技術(shù)的精準(zhǔn)定性定量分析可為肉類成分的檢測(cè)開辟一個(gè)新途徑。肉制品加工工藝從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步對(duì)肉制品真實(shí)性鑒別技術(shù)提出更高要求，預(yù)期未來可通過多組學(xué)、多技術(shù)相互融合發(fā)展。因此，發(fā)揮肉及肉制品安全檢測(cè)技術(shù)的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，將成為重要的技術(shù)開發(fā)的發(fā)展方向，為檢測(cè)肉及肉制品真實(shí)性問題提供更為完善的技術(shù)支撐，保障肉及肉制品的安全性。