鄭遠榮，騰軍偉，劉振民

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

干酪是一種新鮮或發(fā)酵乳制品，具有悠久的歷史，全世界生產(chǎn)干酪的品種數(shù)以千計。其中，藍紋干酪、卡門貝爾干酪和布里干酪等霉菌成熟干酪因其獨特的風味和口感受到消費者的青睞[1-2]。制備霉菌成熟干酪時，國外常用的發(fā)酵劑有羅克福爾青霉、卡門培爾青霉和白地霉等[3-6]。在成熟過程中，霉菌成熟干酪的主要生化變化涉及蛋白水解、脂肪分解以及乳糖、乳酸和其他化合物的代謝[7-9]。但是，在這些常用的霉菌干酪發(fā)酵劑中，部分發(fā)酵劑會使蛋白質(zhì)和脂肪深度水解，導(dǎo)致異味的產(chǎn)生，不符合部分消費者的期待。

紅曲霉屬是我國用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的傳統(tǒng)食用菌。許多研究表明，紅曲霉的代謝產(chǎn)物中存在莫納可林K、γ-氨基丁酸、紅曲色素和其他生物活性化合物[10-16]。紅曲霉屬對食品中的成分具有良好的糖化、酯化和蛋白水解能力，長期在東亞用于生產(chǎn)發(fā)紅曲米、腐乳、玫瑰香醋、米酒和其他食品[17-19]，在人類長期食用的馴化過程中，具有良好的安全性。紅曲霉屬在干酪的制作方面具有良好潛力，但該方面的研究目前相對較少。

因此，本研究采用紅曲霉作為附屬發(fā)酵劑，在軟質(zhì)干酪生產(chǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上生產(chǎn)干酪，目的是研究紅曲霉對干酪成熟過程中理化性質(zhì)和風味的影響，為紅曲霉在干酪中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料牛乳由光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供。

紅曲霉（Monascus） 中國普通微生物菌種保藏管理中心（編號CGMCC No.7630）；發(fā)酵劑Flora、發(fā)酵劑STI-13 丹麥科漢森股份有限公司；凝乳酶（酶活力：2 080～2 305 IMCU/mL） 丹尼斯克（中國）有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-2112B水平搖床 天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司；MJ-250-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱 杭州藍天儀器有限公司；Thermo 1389生物安全柜 美國Thermo公司；ME2002E/02電子天平、FE20實驗室pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LaB6掃描電子顯微鏡 捷克Tescan公司；5975氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀（頂空固相微萃?。?、1260 Infinity高效液相色譜系統(tǒng) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉發(fā)酵劑的準備

孢子懸浮液制備：將10 mL紅曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，在30 ℃條件下培養(yǎng)1 周，用無菌水洗脫固體培養(yǎng)基上的孢子，鏡檢孢子懸浮液，隨后適當稀釋懸浮液，使其濃度為106個/mL。

1.3.2 干酪的制作

紅曲霉干酪的制備：參考Jiao Jingkai等[8]方法，牛乳經(jīng)標準化（脂肪與蛋白質(zhì)含量比值為1.5∶1～1.7∶1）、巴氏殺菌后冷卻至32 ℃，加入商業(yè)發(fā)酵劑0.04 g/L（其中Flora 0.012 g/L、STI-13 0.028 g/L）與1.3.1節(jié)制備的霉菌發(fā)酵劑1.5 mL/kg，恒溫發(fā)酵1.5 h，隨后加入凝乳酶0.005 g/kg，待凝乳后進行切割、裝模、成型、17 g/100 mL鹽水腌漬、晾干等步驟，最后將干酪轉(zhuǎn)移至成熟室進行成熟，成熟21 d時測定除pH值外的其他指標，成熟28 d時測定pH值。對照樣品的制備：除發(fā)酵劑部分不加入1.3.1節(jié)制備的霉菌發(fā)酵劑，其余部分相同。干酪得率按下式計算。

式中：m1為投入的牛乳質(zhì)量/g；m2為成型后的凝乳塊質(zhì)量/g。

1.3.3 干酪理化指標的測定

根據(jù)Batty等[20]描述的方法測定干酪的蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、水分、鹽含量及pH值，重復(fù)測定3 次。

1.3.4 干酪游離氨基酸的測定

參考鄭曉吉[21]的方法，采用反相高效液相色譜-紫外檢測法測定干酪中游離氨基酸。

1.3.5 干酪微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考鄭遠榮等[22]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察紅曲霉干酪成熟過程中的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 干酪揮發(fā)性成分的定性及定量分析

根據(jù)Criste等[23]描述的方法進行修改，利用GC-MS儀進行測定，從50 ℃開始程序升溫，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至100 ℃，然后以10 ℃/min的速率從100 ℃升至200 ℃，最后保持10 min。GC進樣口溫度設(shè)置為250 ℃，進樣在不分流模式下進行，載氣為氦氣，質(zhì)譜儀的離子源溫度保持在230 ℃，使用電子撞擊模式（70 eV），m/z45～450條件下以1 次/s的速率收集數(shù)據(jù)。依據(jù)NIST 11譜庫檢索，采用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，結(jié)果表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉對干酪理化指標的影響

由表1可知，紅曲霉干酪的得率為（16.55±0.67）%，與其他種類干酪（如切達干酪，一般得率為8%～10%）相比得率較高[24]。主要原因是本研究的紅曲霉干酪是一種軟質(zhì)干酪，水分含量較高。干酪中的脂肪/蛋白質(zhì)含量比值會比原料乳略微提高，主要是由于乳清的排放會流失大部分乳清蛋白。鈣會隨著酪蛋白而保留下來，并且含量得到很大程度的濃縮，在成熟結(jié)束時鈣含量為（376.67±37.86） mg/100 g，水分含量為（44.47±2.70）%，與硬質(zhì)干酪、半硬質(zhì)干酪相比有著較高的水分含量。鹽含量為（863.67±54.60） mg/100 g，與其他霉菌成熟干酪的鹽含量相比相對較低[24]。鹽含量主要和加工過程中添加食鹽的量有關(guān)，適當?shù)柠}度可以抑制雜菌的生長，調(diào)節(jié)干酪的成熟速率和水解深度，并且給終產(chǎn)品帶來良好的風味和滋味。

表1 紅曲霉干酪成熟期結(jié)束時的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of Monascus-fermented cheese at the end of maturation

2.2 紅曲霉干酪成熟期間pH值變化

由圖1可知，紅曲霉干酪在成熟期間發(fā)生了pH值中和現(xiàn)象，這與其他霉熟干酪[25-26]相同。實驗組干酪在成熟過程中pH值呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，這是由于成熟前期主要由乳酸菌進行產(chǎn)酸活動，分解殘留的乳糖。待成熟至7 d左右，隨著輔助發(fā)酵劑紅曲霉的生長，干酪基質(zhì)中的乳酸成分被消耗，同時釋放游離氨基酸脫氨和脫羧過程中產(chǎn)生的堿性物質(zhì)。成熟期結(jié)束時，紅曲霉干酪pH值為5.0～5.1，與Langres干酪的pH值接近，低于藍紋干酪的pH值[25,27]?？赡苁怯捎诩t曲霉的蛋白質(zhì)水解能力稍弱于藍紋干酪所用的洛克福特青霉。

圖1 紅曲霉干酪成熟期間各時期pH值Fig.1 Change in pH value of Monascus-fermented cheese during ripening

2.3 紅曲霉干酪中游離氨基酸的測定結(jié)果

由表2可知，成熟前后共檢測出23 種氨基酸。干酪經(jīng)過成熟后，游離氨基酸含量明顯增加，平均含量從35.2 ng/mg增加到906.2 ng/mg，平均增加58.8 倍。特別是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸等氨基酸增加幅度均在50 倍以上，增加幅度最高的是天冬氨酸，高達533 倍。成熟后氨基酸含量高于1 000 ng/mg的有賴氨酸、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸，其中賴氨酸含量最高，可達2 857.48 ng/mg。異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸8 種必需氨基酸含量從47.2 ng/mg增加到1 205.7 ng/mg，平均增加31 倍。此外，紅曲霉發(fā)酵的功能性代謝產(chǎn)物γ-氨基丁酸已被證明可以有效改善抑郁癥及發(fā)揮血壓調(diào)節(jié)作用[28]，在該干酪成熟期結(jié)束時，γ-氨基丁酸含量高達328.14 ng/mg。

表2 紅曲霉干酪成熟前后游離氨基酸含量Table 2 Changes in free amino acid contents before and after the ripening of Monascus-fermented cheese ng/mg

2.4 紅曲霉干酪微觀結(jié)構(gòu)的變化

由圖2可知，對照組酪蛋白微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加完整和清晰，中間孔洞較大。與對照組干酪相比，實驗組紅曲霉干酪的微觀結(jié)構(gòu)比較模糊，內(nèi)部孔洞更小，表明紅曲霉菌株對成熟干酪的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有明顯影響，紅曲霉菌株分泌的胞外蛋白酶對干酪中蛋白質(zhì)和脂肪等成分進行了不同程度的水解，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行了重新排列。從宏觀上來看，對照組干酪外觀較硬且富有彈性，而紅曲霉干酪內(nèi)部則出現(xiàn)一定的軟化塌陷，但未出現(xiàn)流心質(zhì)地。干酪的微觀結(jié)構(gòu)是由酪蛋白基質(zhì)組成的，酪蛋白是連續(xù)相，脂肪和水分等分散在其中，形成空穴結(jié)構(gòu)；而實驗組紅曲霉干酪中紅曲霉的蛋白水解能力比乳酸菌強，在成熟過程中，以酪蛋白為主的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)骨架分解塌陷，與脂肪、水分混合在一起，從而形成相對致密的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 成熟21 d紅曲霉干酪掃描電子顯微圖Fig.2 Scanning electron micrograph of Monascus-fermented cheese matured for 21 days

2.5 紅曲霉干酪揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

由表3可知，通過GC-MS方法在成熟期結(jié)束時于對照組與實驗組干酪中鑒定出32 種揮發(fā)性化合物，其中包括12 種酯類、16 種醇類、3 種酮類、1 種醛類。紅曲霉軟質(zhì)干酪從成熟前到成熟后，呈味酯類物質(zhì)明顯增多，醇類物質(zhì)含量明顯降低，整體上干酪風味物質(zhì)更加豐富。

表3 紅曲霉干酪成熟前后揮發(fā)性風味物質(zhì)組成Table 3 Changes in composition of volatile flavor compounds before and after the ripening of Monascus-fermented cheese

2.5.1 酯類揮發(fā)性化合物

紅曲霉軟質(zhì)干酪的主要揮發(fā)性風味成分包括酯類，共鑒定出12 種酯類物質(zhì)，在成熟前占總揮發(fā)性化合物含量的6.26%，成熟后占總揮發(fā)性化合物含量的54.7%。其中，乙酯類物質(zhì)占比最大，一些乙酯類物質(zhì)可提供果香味，如乙酸乙酯、辛酸乙酯等[29]。與對照組相比，成熟后干酪中乙酯類物質(zhì)的含量顯著增加。此外，在實驗組還發(fā)現(xiàn)了己酸-2-甲基丙酯、甲酸辛酯和己酸異戊酯等，這些物質(zhì)是實驗組獨有的。因此，可以合理推測，這些實驗組中獨有的酯類物質(zhì)是導(dǎo)致紅曲霉軟質(zhì)干酪風味的重要揮發(fā)性物質(zhì)。

2.5.2 醇類揮發(fā)性化合物

醇類物質(zhì)為含量最高的風味成分，占總揮發(fā)性化合物含量的25.94%。與對照組相比，實驗組干酪中的醇類物質(zhì)種類及含量均有所下降。在成熟21 d時，主要醇類物質(zhì)為乙醇，通常在干酪中由乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生，其次是3-甲基-1-丁醇和苯乙醇。其中，3-甲基-1-丁醇能帶來令人愉悅的新鮮干酪味[30]，2-庚醇與2-壬醇可為干酪提供奶油香氣[31]。

2.5.3 其他揮發(fā)性化合物

其他揮發(fā)性化合物包括酮類、醛類，種類均較少。從成熟21 d干酪中揮發(fā)性化合物的檢測結(jié)果來看，酮類物質(zhì)占所有揮發(fā)性化合物的12.82%。其中，2-庚酮的含量最為豐富，且為實驗組中獨有的成分，對照組中并未檢出，其次是2-戊酮和2-壬酮，它們都是藍紋干酪成熟過程中脂肪酸分解而導(dǎo)致的特征風味物質(zhì)[32]。與此同時，從成熟期結(jié)束時的測定結(jié)果來看，醛類物質(zhì)的含量與種類并沒有得到提高，這可能是因為它們被還原為相應(yīng)的醇類物質(zhì)[30]。

3 結(jié) 論

利用紅曲霉發(fā)酵液制備霉菌成熟干酪，并對成熟前后干酪的理化性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)和風味物質(zhì)進行研究。結(jié)果表明：紅曲霉干酪在成熟期結(jié)束時的理化性質(zhì)較其他品種干酪及對照組差異顯著，尤其是干酪得率為16.55%，顯著高于其他品種干酪，鹽含量為863.67 mg/100 g，顯著低于其他霉熟干酪的平均水平；在成熟過程中，紅曲霉干酪pH值和其他霉菌成熟干酪一樣呈現(xiàn)出酸中和的現(xiàn)象；成熟期前后，共鑒定出23 種游離氨基酸，成熟前后平均增長幅度高達58.8 倍，這些游離氨基酸對紅曲霉干酪的風味形成具有重要貢獻，部分游離氨基酸還具有一定功效性，如γ-氨基丁酸；在紅曲霉干酪中，共檢測到32 種揮發(fā)性化合物，其中醇類物質(zhì)初始含量最高，成熟后酯類物質(zhì)含量最高，其中出現(xiàn)一些實驗組獨有而對照組中不存在的化合物，認為這些物質(zhì)是導(dǎo)致紅曲霉干酪形成特征風味的主要物質(zhì)。通過以上研究，認為紅曲霉適宜作為干酪的輔助發(fā)酵劑，對干酪成熟具有積極作用，可為干酪?guī)砀泄佥^佳的特征風味物質(zhì)。