郭勇 郭辰峻 張婕 寧小娜 陳曦 嚴宏

1西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院) 陜西省眼科醫(yī)院，西安 710004；2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院眼科，西安 710038；3重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010

老化、輻射、遺傳、中毒、外傷、免疫、局部代謝和營養(yǎng)障礙等各種內(nèi)外源因素均可導(dǎo)致白內(nèi)障。白內(nèi)障的致病因素眾多，發(fā)病機制尚不清楚。氧化應(yīng)激和自由基損傷是各種因素導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的共同途徑[1]。近年的研究證實，健康晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)內(nèi)存在多重抗氧化防線，致病因素產(chǎn)生的自由基會被晶狀體內(nèi)第一道防線，即抗氧化物和抗氧化酶清理，當抗氧化酶被消耗，第二道防線，即抗氧化酶修復(fù)系統(tǒng)將被激活。第二道防線主要包括硫醇轉(zhuǎn)移酶/谷氧還蛋白(thioltransferase/glutaredoxin，TTase/Grxs)和硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin/thioredoxin reductase，Trxs/TrxsR)動態(tài)系統(tǒng)，其通過控制硫醇/二硫化物的含量，修復(fù)晶狀體氧化/抗氧化動態(tài)平衡[2]。TTase/Grxs存在2種亞型，包括分布在細胞質(zhì)中的谷氧還蛋白1(glutaredoxin 1，Grx1)和分布在線粒體及細胞核中的Grx2。Grx1和Grx2是同工酶，均可發(fā)生脫硫醇反應(yīng)，修復(fù)抗氧化酶和抗氧化物，維持抗氧化動態(tài)平衡[3-4]。Grx2是清除自由基、修復(fù)LECs、保護LECs活性和防治白內(nèi)障形成的重要物質(zhì)[5]。然而，目前仍缺乏Grx2抑制晶狀體混濁在組織及動物層面的證據(jù)。本研究通過成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)基因位點9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9)建立Grx2基因敲除(knockout，KO)和基因敲入(knockin，KI)小鼠模型，觀察小鼠晶狀體混濁的發(fā)生和發(fā)展情況，探討Grx2在白內(nèi)障發(fā)病機制中的作用，以期為白內(nèi)障的藥物防治研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 將10只清潔級黑色C57BL/6J品系雄鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物中心提供)平均分為2個組，分別進行Grx2KO和KI。飼養(yǎng)于清潔級層流動物房內(nèi)，光照時間為6：00—18：00，室溫20 ℃。采用無菌飲用水、飼料和敷料飼養(yǎng)。實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境達到國家標準《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》(GB14925)。實驗動物的使用和喂養(yǎng)遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》，本研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批[批文號：2020年科倫審第(125)號]。

1.1.2主要試劑及儀器 REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒(美國Sigma公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)；小鼠Grx2抗體(ab167207)、小鼠谷胱甘肽(glutathione，GSH)單克隆抗體(ab19534)(美國Abcam公司)；兔二硫化谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)多克隆抗體(AB5010，美國Sigma-Aldrich公司)；β-actin(GB11001)，HRP標記的山羊抗小鼠(G1214)、山羊抗兔二抗(G1213)(武漢賽維爾生物科技有限公司)；兔B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體(26593-1-AP)、兔Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體(50599-2-Ig)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；DCFH-DA(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-desoxyguanosine，8-OHdG)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物技術(shù)有限公司)。PCR儀(美國Bio-Rad公司)；裂隙燈顯微鏡(SL130型，德國Carl Zeiss公司)；光學(xué)顯微鏡(CKX53型，日本Olympus公司)；熒光分光光度儀(美國Epoch公司)；ECL蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1Grx2KO小鼠模型的建立 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)[6]，參考文獻[7]方法敲除Grx2基因。主要步驟包括：(1)載體設(shè)計和構(gòu)建 主要包括設(shè)計小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)識別序列以及構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒并進行測序驗證。(2)體外轉(zhuǎn)錄 主要包括Cas9、sgRNA質(zhì)粒的提取和純化以及其體外轉(zhuǎn)錄和純化。(3)原核注射 主要包括小鼠的超數(shù)排卵，注射受精卵后移植，得到F0代小鼠。(4)小鼠基因鑒定 主要包括通過PCR和測序驗證Grx2KO小鼠，并進一步測序明確突變序列。

1.2.2Grx2KI小鼠模型的建立 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和同源重組載體(Donor vector)將Grx2基因插入到目標鏈特定的位置。主要步驟包括：(1)制作向?qū)NA(guide RNA，gRNA)和Donor vector 準備CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要使用的質(zhì)粒，設(shè)計完成gRNA，并在小鼠體外進行轉(zhuǎn)錄，完成Donor vector的制備。(2)小鼠受精卵注射 給予小鼠體外受精獲得受精卵，向受精卵顯微注射準備好的gRNA、Donor vector和Cas9蛋白。(3)受精卵內(nèi)CRISPR/Cas9系統(tǒng)開始工作 gRNA負責引導(dǎo)，Cas9蛋白負責在雙鏈DNA特定位點進行剪切，Donor vector負責插入Grx2基因并修復(fù)雙鏈DNA[8]。

1.2.3實驗小鼠的繁殖及測序 雜合子、品系為C57BL/6J-Grx2KO和C57BL/6J-Grx2KI小鼠飼養(yǎng)于清潔級層流動物房內(nèi)。剪腳趾進行標號，記錄，前肢表示十位數(shù)，后肢表示個位數(shù)。使用無菌處理的水、食物和墊料，分隔飼養(yǎng)。1月齡發(fā)情期后，采用1雄1雌自然配繁。擴繁至5個隔離籠后供給后續(xù)實驗。母鼠經(jīng)過約20 d孕期，生育小鼠，小鼠1周齡后分籠飼養(yǎng)，發(fā)育可。采用REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒進行小鼠基因測序。純合子Grx2KO的小鼠2條DNA條帶都發(fā)生了Grx2基因序列的缺失，因此基因型記錄為KO-KO；同理，野生型(wild type，WT)小鼠基因型記錄為WT-WT，Grx2KO雜合子小鼠基因型記錄為KO-WT，純合子Grx2KI小鼠基因型記錄為KI-KI，Grx2KI雜合子小鼠基因型記錄為KI-WT。

1.2.4裂隙燈顯微鏡觀察小鼠晶狀體混濁情況 每周使用裂隙燈顯微鏡觀察Grx2KO、Grx2KI和C57BL/6JWT小鼠晶狀體混濁情況，至5月齡時觀察結(jié)束。給予小鼠局部聯(lián)合質(zhì)量分數(shù)0.5%托吡卡胺和0.5%去氧腎上腺素滴眼液點眼，充分擴瞳，1次/5 min，共3次，15 min后，采用裂隙燈顯微鏡裂隙光源15°入射角，正面觀察小鼠晶狀體，記錄晶狀體混濁的部位和程度。參考牛津大學(xué)離體大鼠晶狀體分級系統(tǒng)[9]對小鼠晶狀體進行分級：晶狀體完全透明為0級；晶狀體透明但皮質(zhì)出現(xiàn)散在空泡為1級；晶狀體核密度輕度增加，晶狀體囊膜開始混濁，皮質(zhì)出現(xiàn)較多空泡為2級；晶狀體核密度增加，皮質(zhì)出現(xiàn)白色片狀混濁為3級；晶狀體完全呈現(xiàn)白色混濁為4級。

1.2.5蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠晶狀體、心臟、腦、肝臟和肌肉組織病理學(xué)改變 飼養(yǎng)第19個月，使用CO2處死實驗小鼠，同時摘出眼球，使用解剖顯微鏡和顯微眼科手術(shù)器械，從赤道部剪開小鼠眼球，完整剝離晶狀體，不損傷晶狀體囊膜，立即使用電子天平測量小鼠晶狀體質(zhì)量，隨機選取5枚晶狀體放入含有質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛的塑料包埋盒內(nèi)，標號，保存，給予蘇木精-伊紅染色，其余晶狀體均用干冰冷凍干燥，放入-80 ℃冰箱保存待用。摘出眼球后，用眼科剪解剖小鼠，取出小鼠的心臟、大腦、肝臟和肌肉等代謝旺盛組織。用眼科剪將組織分割成5 mm×5 mm×2 mm大小，立即放入含有4%多聚甲醛的塑料包埋盒內(nèi)，標號，保存，進行蘇木精-伊紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理學(xué)改變。

1.2.6ELISA法測定小鼠晶狀體ROS和8-OHdG含量 將-80 ℃冰箱保存的晶狀體裂解，勻漿，取上清液，分別采用ROS和8-OHdG ELISA試劑盒說明書操作方法進行檢測。采用熒光分光光度儀測量晶狀體內(nèi)ROS和8-OHdG含量。

1.2.7Western blot法測定小鼠晶狀體氧化應(yīng)激相關(guān)指標蛋白相對表達量 提取晶狀體蛋白溶液，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白在質(zhì)量分數(shù)12%聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。按照Grx2、GSH、Bcl-2、GSSG、Bax、β-actin一抗稀釋比例均為1∶ 1 000，4 ℃孵育8 h；二抗稀釋比例均為1∶ 4 000，室溫孵育2 h。使用ECL蛋白印跡檢測系統(tǒng)進行檢測，通過ImageJ圖像灰度值分析Grx2、GSH、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Grx2 KO小鼠基因測序

F1代18#～31#小鼠DNA電泳結(jié)果顯示，26#、28#、30#、31#小鼠在580 bp和883 bp擴增出2個條帶，為KO-WT小鼠(圖1)。Grx2KO小鼠F2代基因鑒定電泳結(jié)果顯示，KO-KO擴增出580 bp 1個條帶，WT-WT擴增出883 bp 1個條帶，KO-WT擴增出580 bp和883 bp 2個條帶(圖2)。

圖1 Grx2 KO F1代小鼠PCR擴增產(chǎn)物電泳圖 Grx2 KO小鼠擴增出580 bp和883 bp 2個條帶 數(shù)字為鼠尾號，B6為陰性對照，N為空白對照Figure 1 Electrophoretogram of PCR amplicon for Grx2 KO F1 mice A 580 bp and an 883 bp fragments were amplified from Grx2 KO mice.Numbers were mouse tail marking numbers.B6 was negative control，and N was blank control

圖2 Grx2 KO F2代小鼠PCR擴增產(chǎn)物電泳圖 KO-KO擴增出580 bp條帶，WT-WT擴增出883 bp條帶，KO-WT擴增出580 bp和883 bp 2個條帶 數(shù)字為鼠編號，B6為陰性對照，N為空白對照Figure 2 Electrophoretogram of PCR amplicon of Grx2 KO F2 mice KO-KO amplified a 580 bp fragment.WT-WT amplified an 883 bp fragment.KO-WT amplified a 580 bp and an 883 bp fragments.Numbers were mouse marking numbers.B6 was negative control，and N was blank control

2.2 Grx2 KI小鼠基因測序

對Grx2KI小鼠進行基因擴增，經(jīng)PCR擴增和測序確認，110#、113#、114#、115#、118#小鼠為KI-KI純合子F2代小鼠(圖3)。

2.3 小鼠一般情況

對Grx2KO小鼠和Grx2KI小鼠進行培育，獲得小鼠數(shù)量見表1。Grx2KO小鼠、Grx2KI小鼠和WT小鼠均狀況良好，在大小、習(xí)性、體質(zhì)量及生長發(fā)育方面，3種基因型小鼠相似。1～19月齡時，同月齡Grx2KO、Grx2KI和WT小鼠晶狀體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(圖4)。

圖3 Grx2 KI F2代小鼠PCR引物電泳圖 KI-KI擴增出1 465 bp和2 292 bp，WT-WT擴增出412 bp，KO-WT擴增出所有條帶 數(shù)字為鼠尾號，P為陽性對照，WT為C57BL/6J野生型，N為空白對照，M為DNA marker，5'arm為基因的5'端，3'arm為基因的3'端，WT為野生型基因片段Figure 3 Electrophoretogram of PCR primers of Grx2 KI F2 mice A 1 465 bp and a 2 292 bp fragments were amplified from the KI-KI mouse.A 412 bp fragment was amplified from the WT-WT mouse.All fragments were amplified from the KO-WT mouse.Numbers were mouse tail marking numbers.P was for positive control，WT for wild-type C57BL/6J mouse，N for blank control，M for DNA Marker.5' arm was the 5' end of the gene, and 3' arm was the 3' end of the gene,and WT indicated wild-type gene fragment

表1 小鼠繁殖情況(只)Table 1 Reproduction of mice (n)傳代KO-KOKO-WTKI-KIKI-WTF00101F10402F2203257F332141823F468112096 注:KO:基因敲除;KI:基因敲入;WT:野生型 Note:KO:knockout;KI:knockin;WT:wild type

圖4 小鼠晶狀體質(zhì)量比較 F=0.469,P=0.739(單因素方差分析) 1～19月齡時，同月齡各組小鼠晶狀體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05) WT：野生型(n=120)；KO：基因敲除(n=136)；KI：基因敲入(n=40)Figure 4 Body weight comparison of mouse lens F=0.469,P=0.739 (One-way ANOVA) From 1 to 19 months，no significant difference was found in lens weight among mice of the same age (all at P>0.05) WT:wild type (n=120);KO:knockout (n=136);KI:knockin (n=40)

2.4 不同基因型小鼠晶狀體表現(xiàn)

最初2個月，Grx2KO、Grx2KI和WT小鼠晶狀體均保持透明。3月齡時，Grx2KO小鼠晶狀體周邊僅出現(xiàn)少量空泡；4月齡時，開始出現(xiàn)輕微核密度增加；5月齡時，Grx2KO小鼠晶狀體出現(xiàn)片狀混濁，僅1只小鼠出現(xiàn)完全混濁。WT小鼠5月齡時，晶狀體周邊僅有少量空泡出現(xiàn)。Grx2KI小鼠晶狀體一直保持透明(圖5，表2)。

2.5 不同基因型小鼠晶狀體組織病理學(xué)改變

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，5月齡小鼠晶狀體LECs呈深色，位于淺層皮質(zhì)；晶狀體纖維規(guī)則排列，呈紅色。組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示，Grx2KO小鼠與Grx2KI、WT小鼠相比，晶狀體纖維水腫，可見晶狀體纖維斷裂、纖維間出現(xiàn)空泡和縫隙(圖6)。

2.6 不同基因型小鼠心臟、腦、肝臟、肌肉的組織病理學(xué)變化

5月齡時，Grx2KO和Grx2KI小鼠心、腦、肝臟、肌肉未見明顯損害，Grx2KO小鼠組織纖維間隙略增加，但與Grx2KI和WT小鼠相比，無明顯變化(圖7)。

圖5 參考牛津大學(xué)大鼠晶狀體分級系統(tǒng)[9]對小鼠晶狀體混濁程度分級 A：0級 B：1級 C：2級 D：3級 E：4級Figure 5 Opacity degree grading of mouse lens according to Oxford Clinical Cataract Classification and Grading System[9] A:Grade 0 B:Grade 1 C:Grade 2 D:Grade 3 E:Grade 4

表2 3種基因型小鼠晶狀體混濁級別比較[M(Q1,Q3)]Table 2 Comparison of lens opacity grade among Grx2 KO,Grx2 KI and WT mice (M[Q1,Q3])基因型眼數(shù)1月齡2月齡3月齡4月齡5月齡Grx2 KO400(0,0)0(0,1)1(0,2)2(1,3)3(1,4)Grx2 KI400(0,0)0(0,0)0(0,0)0(0,0)0(0,0)WT600(0,0)0(0,0)0(0,1)1(0,2)1(0,2) 注:KO:基因敲除;KI:基因敲入;WT:野生型 Note:KO:knockout;KI:knockin;WT:wild type

圖6 各基因型小鼠晶狀體組織病理變化(HE) 與WT小鼠和Grx2 KI小鼠相比，Grx2 KO小鼠晶狀體纖維斷裂，纖維間出現(xiàn)空泡和縫隙 A：Grx2 KO (×100，標尺=1 000 μm) B：WT (×100，標尺=1 000 μm) C：Grx2 KI (×100，標尺=1 000 μm) D：Grx2 KO (×200，標尺=500 μm) E：WT (×200，標尺=500 μm) F：Grx2 KI (×200，標尺=500 μm)Figure 6 Histopathological changes of lens in Grx2 KO，Grx2 KI and WT mice (HE) Compared with WT and Grx2 KI mice，the lens fibers of Grx2 KO mice were fractured with vacuoles and gaps between fibers A:Grx2 KO (×100，bar=1 000 μm) B:WT (×100，bar=1 000 μm) C:Grx2 KI (×100，bar=1 000 μm) D:Grx2 KO (×200，bar=500 μm) E:WT (×200，bar=500 μm) F:Grx2 KI (×200，bar=500 μm)

圖7 各基因型小鼠心臟、腦、肝臟、肌肉的組織病理學(xué)變化(HE ×200，標尺=500 μm) 與WT小鼠和Grx2 KI小鼠相比，Grx2 KO小鼠組織纖維間隙略增加 KO：基因敲除；WT：野生型；KI：基因敲入Figure 7 Pathological changes of heart，brain，liver and muscle in Grx2 KO，Grx2 KI and WT mice (HE ×200，bar=500 μm) Compared with WT and Grx2 KI mice，the fiber space of Grx2 KO mice was slightly increased KO:knockout;WT:wild type;KI:knockin

圖8 Grx2 KO小鼠與WT小鼠晶狀體中8-OHdG和ROS含量比較(獨立樣本t檢驗，n=3) 與WT小鼠比較，a P<0.05 A：8-OHdG B：ROS 8-OHdG：8-羥基脫氧鳥苷；WT：野生型；KO：基因敲除；ROS：活性氧簇Figure 8 Comparison of 8-OHdG and ROS content in lens between Grx2 KO and WT mice (Independent samples t test，n=3) Compared with WT mice，a P<0.05 A：8-OHdG B：ROS 8-OHdG:8-hydroxy-deoxyguanosine;WT：wild type;KO:knockout;ROS:reactive oxygen species

2.7 Grx2 KO小鼠與WT小鼠晶狀體8-OHdG和ROS含量比較

5月齡Grx2KO小鼠晶狀體8-OHdG含量為(3.886±0.326)ng/ml，高于WT小鼠的(3.531±0.250)ng/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.711，P=0.033)(圖8)。Grx2KO小鼠晶狀體ROS熒光強度為1 594±132，高于WT小鼠的1 157±123，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.384，P=0.028)(圖9)。

2.9 Grx2 KO小鼠與WT小鼠晶狀體Grx2、Bcl-2、GSH、GSSG、Bax蛋白相對表達量比較

5月齡Grx2KO小鼠晶狀體中Grx2、GSH和Bcl-2相對表達量分別為0.23±0.01、0.70±0.06和0.32±0.03，較WT小鼠的0.52±0.02、1.04±0.08和0.49±0.04下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.815，P=0.020；t=2.457，P=0.033；t=2.279，P=0.041)；Grx2KO小鼠晶狀體中GSSG和Bax相對表達量分別為0.34±0.03和0.16±0.01，與WT小鼠的0.41±0.03和0.18±0.01比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.933、0.752，均P>0.05)(圖9)。

圖9 Grx2 KO小鼠與WT小鼠晶狀體中Grx2、Bcl-2、GSSG、GSH和Bax蛋白表達比較 A：Western blot電泳圖 B：Grx2、Bcl-2、GSSG、GSH和Bax蛋白相對表達量比較 與WT小鼠比較，a P<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) WT：野生型；KO：基因敲除；GSSG：二硫化谷胱甘肽；GSH：谷胱甘肽；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2基因；Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白Figure 9 Comparison of Grx2，Bcl-2，GSSG，GSH and Bax relative expressions in lens between Grx2 KO and WT mice A:Western blot electrophoretogram B:Comparison of relative expressions of Grx2，Bcl-2，GSSG，GSH and Bax Compared with WT mice，a P<0.05 (Independent samples t test，n=3) WT:wild type;KO:knockout;GSSG:glutathione disulfide;GSH:glutathione;Bcl-2:B cell lymphoma-2 gene;Bax:Bcl-2-associated X protein

3 討論

Grx存在多樣性，其中Grx2有3種亞型，Grx3和Grx5有2種亞型[10]。Grx2廣泛表達于人體器官內(nèi)，參與細胞抗氧化的第二道防線，修復(fù)細胞內(nèi)的GSH/GSSG動態(tài)平衡，恢復(fù)體內(nèi)的氧化/抗氧化穩(wěn)定狀態(tài)[11-12]。正常生理狀態(tài)下，2分子Grx2和2分子GSH通過硫鐵簇相互結(jié)合成二聚體的結(jié)晶狀態(tài)，對細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激更為敏感。當活性氧自由基出現(xiàn)，晶狀體空間構(gòu)型立刻還原為2分子GSH和2分子Grx2，分別發(fā)揮抗氧化作用[13-14]。Grx2廣泛分布在人體器官中，其中角膜、虹膜、晶狀體、視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中均已發(fā)現(xiàn)了Grx2的表達[15]。

線粒體與LECs的代謝、分裂、增生和分化密切相關(guān)，對維持晶狀體正常生理功能發(fā)揮著巨大作用[16-17]。分布在線粒體中的同工酶Grx2可直接保護晶狀體蛋白和酶，其通過調(diào)控細胞內(nèi)的巰基維持晶狀體透明狀態(tài)。近年來，基因敲除小鼠是國內(nèi)外進行基因及相應(yīng)蛋白功能研究的熱點。本課題組2010年與美國內(nèi)布拉斯加州大學(xué)合作，首次以Grx1基因敲除小鼠作為模型，對其白內(nèi)障的發(fā)生情況及各生化指標隨年齡的變化進行了觀察和研究[18-19]，為Grx1基因敲除小鼠的制作和繁育積累了一定經(jīng)驗。Wu等[7]采用ES打靶法構(gòu)建Grx2敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠3月齡時開始出現(xiàn)晶狀體混濁。為了進一步探明Grx2基因在白內(nèi)障發(fā)病中的作用，2014年美國內(nèi)布拉斯加州大學(xué)Marjorie F.Lou教授再次采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)制作了Grx2基因敲除小鼠，探明白內(nèi)障的形成和線粒體功能的關(guān)系[20]。與ES打靶法相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在敲除鼠中有一定的優(yōu)勢，縮短了基因鼠的構(gòu)建周期。但在Grx2基因敲除的策略上，兩者都選擇了敲除外顯子2。在敲除的效果上，2種敲除方法對Grx2蛋白表達量影響無明顯差異。本課題組與Marjorie F.Lou教授繼續(xù)合作，制作B6J-Grx2KO小鼠，并在國際上首次制作了B6J-Grx2KI小鼠，利用B6J-Grx2KO和B6J-Grx2KI小鼠模型，研究白內(nèi)障發(fā)生過程中Grx2擔任的角色和抑制晶狀體混濁的分子機制。

本研究中，Grx2KO小鼠發(fā)育正常，除了體質(zhì)量略輕于WT小鼠外，未見其他全身性變化。這一現(xiàn)象在Grx家族另一成員Grx1KO小鼠中也有表現(xiàn)[21]。線粒體是主要的能量代謝場所，為了解Grx2KO小鼠是否有全身性異常，本研究對小鼠代謝旺盛的部位(心臟、大腦、肝臟和肌肉)均進行組織病理學(xué)分析，結(jié)果顯示Grx2KO和Grx2KI小鼠各個器官并未見明顯異常，這說明Grx2基因的缺失或表達上調(diào)均未導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常，未引起細胞病理改變。

然而對晶狀體進行觀察時，卻發(fā)現(xiàn)從3月齡開始，Grx2KO小鼠晶狀體出現(xiàn)了少量空泡，從4月齡到5月齡，Grx2KO小鼠晶狀體混濁加快。同一年齡段的WT小鼠晶狀體只有少許空泡出現(xiàn)。然而，觀察的5個月內(nèi)，Grx2KI小鼠晶狀體一直保持透明。晶狀體無血管和神經(jīng)分布，主要起屈光折射和調(diào)節(jié)作用。成年小鼠晶狀體會進入一個快速的生長和分化期，各種內(nèi)源性、外源性應(yīng)激條件均可誘導(dǎo)晶狀體蛋白聚集，最終導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生，氧化應(yīng)激就是其中的主要損傷形式之一[22]。晶狀體內(nèi)的氧化損傷和抗氧化修復(fù)的動態(tài)平衡是維持晶狀體透明的原因。本研究中對Grx2KO小鼠晶狀體的ROS水平進行分析，發(fā)現(xiàn)其遠高于WT小鼠。對DNA氧化損傷標志物8-OHdG水平進行檢測，證實Grx2KO小鼠晶狀體的8-OHdG表達上調(diào)。GSH系統(tǒng)是晶狀體內(nèi)小分子抗氧化物，是晶狀體內(nèi)抗氧化還原平衡主要參與者，還是保護蛋白質(zhì)的巰基與GSSP平衡的關(guān)鍵蛋白。對Grx2KO小鼠晶狀體的GSH系統(tǒng)進行分析證明，與WT小鼠相比，Bcl-2、GSH、Bax蛋白表達水平均下降，這說明作為Grx1的同工酶，Grx2具有相類似的維持GSH/GSSG平衡的作用。

綜上所述，本研究通過建立Grx2KO和Grx2KI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Grx2KO可以加速年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生，同時證實Grx2參與了細胞氧化損傷的修復(fù)。本研究揭示了Grx2對小鼠正常晶狀體生理功能起保護作用。Grx2能夠抑制ROS的產(chǎn)生，下調(diào)8-OHdG的表達，并且能夠保護還原態(tài)的GSH，修復(fù)氧化態(tài)的GSSG。Grx2在修復(fù)晶狀體氧化損傷和維持晶狀體的透明過程中發(fā)揮了重要作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明郭勇：參與實驗設(shè)計、實施研究、論文撰寫；郭辰峻：實驗操作、論文修改；張婕：論文修改；寧小娜：統(tǒng)計數(shù)據(jù)；嚴宏：實驗設(shè)計、論文修改及定稿；陳曦：動物飼養(yǎng)