王旌 朱劍鋒 陸麗娜

上海市眼病防治中心/上海市眼科醫(yī)院 上海市第一人民醫(yī)院 國家眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 上海市眼底病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海眼視覺與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心 上海市眼科疾病精準(zhǔn)診療工程技術(shù)研究中心，上海 200040

腺病毒性結(jié)膜炎好發(fā)季節(jié)為春末至秋初，分為流行性角結(jié)膜炎(epidemic keratoconjunctivitis，EKC)、咽結(jié)膜熱(pharyngeal conjunctival fever，PCF)和單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎，均可通過接觸傳播[1]。EKC和PCF在密閉環(huán)境和高密度人群中極易傳播和流行，甚至爆發(fā)。人類腺病毒(human adenovirus，HAdV)是EKC的主要病原體[2]，其分型與腺病毒性結(jié)膜炎的分型、臨床表現(xiàn)和預(yù)后密切相關(guān)。目前，基因鑒定技術(shù)已基本替代了傳統(tǒng)血清學(xué)檢測用于腺病毒檢測，其中，六鄰體蛋白是常見檢測靶點(diǎn)，可對腺病毒進(jìn)行初步分型，其次是纖維蛋白和五鄰體蛋白，針對纖維蛋白的檢測能夠預(yù)測腺病毒的角膜致病性。與單基因測序相比，六鄰體蛋白及纖維蛋白聯(lián)合測序和系統(tǒng)發(fā)育分析能夠更好地推斷出HAdV分型，以及HAdV對角膜結(jié)膜上皮的黏附力和致病力[3]。腺病毒多基因聯(lián)合測序系統(tǒng)進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析研究較少。本研究對六鄰體蛋白和纖維蛋白進(jìn)行聯(lián)合測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，以期提高腺病毒性結(jié)膜炎分型檢測的敏感性，為準(zhǔn)確預(yù)判流行特征、指導(dǎo)個性化用藥提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 收集2015年1月至2017年8月于上海市眼病防治中心或上海市紅眼病防控辦公室下屬紅眼病監(jiān)測站點(diǎn)就診來自上海市城區(qū)及周邊縣區(qū)的可疑病毒性結(jié)膜炎患者256例，其中男132例，女124例。病毒性結(jié)膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性結(jié)膜充血、水腫，起病后約1周達(dá)發(fā)病高峰，對局部抗生素治療不敏感；(2)大量結(jié)膜濾泡；(3)大量水樣分泌物；(4)可能伴耳前淋巴結(jié)腫大、壓痛；(5)早期可能伴角膜上皮微囊樣病變，進(jìn)而發(fā)展成角膜上皮浸潤，甚至角膜上皮下淺基質(zhì)層白色局部病灶；(6)可能伴上呼吸道感染；(7)可能出現(xiàn)結(jié)膜偽膜。本研究經(jīng)上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：2020科202)，所有被檢者均對本研究目的和過程知情并自愿簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 Hank緩沖液(美國Gibco公司)；QIA-amp mini試劑盒(美國Qiagen公司)；標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量DNA、PCR反應(yīng)緩沖液(美國Invitrogen公司)；TaqDNA聚合酶(5 U/μl，商品單位)、三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(10 μmol/μl，美國Roche公司)；BigDye Terminator試劑盒(美國ABI公司)。紫外分析儀(LMS-20，美國UVP公司)；UV-240紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000，美國ThermoFisher公司)；PCR儀(T100，美國Bio-Rad公司)；測序儀(3130xl，美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 用蘸取生理鹽水的棉簽擦拭患者下穹隆部結(jié)膜囊。棉簽保存在含有50 mg/ml慶大霉素、500 U/ml青霉素、1 mg/ml兩性霉素B和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清蛋白的Hank緩沖液中。

1.2.2HAdV基因組DNA的提取和保存 采用QIA-amp mini試劑盒提取病毒基因組DNA，-20 ℃冰箱內(nèi)保存。通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量DNA對比，在紫外分析儀下觀察，可見1條邊界清楚的金黃色熒光條帶，長度約35 000 bp，無拖尾現(xiàn)象，說明DNA純度和完整性俱佳。采用UV-240紫外分光光度計(jì)檢測DNA的A260/A280值為1.7～1.8，說明DNA樣品未受到蛋白質(zhì)、RNA和碳水化合物等污染。DNA樣品質(zhì)量濃度(μg/μl)=A260×稀釋倍數(shù)×50/1 000。將部分DNA樣本稀釋至10 ng/μl以備PCR使用。剩余DNA于-20 ℃長期保存。

1.2.3HAdV六鄰體蛋白基因測序 對256份樣本分別進(jìn)行六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增，其正向引物序列為5'-AAAGTCTCTCAAACGCCGAC-3'，反向引物序列為5'-CTCCTGTTCGCTTGAACCCA-3'。反應(yīng)體系為20 μl，包括5 U/μl TaqDNA聚合酶0.1 μl，含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μl，10 mol/L dNTP 0.5 μl，10 μmol/μl上、下游引物各0.5 μl，ddH2O 11.4 μl，10 ng/μl模板DNA 5.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min后冷卻至4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外分析儀上成像并攝片，顯示目的片段清晰。六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為3 000 bp，無特異條帶，估測質(zhì)量濃度在30 ng/μl以上。將PCR產(chǎn)物純化后，采用BigDye Terminator試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)，測序引物即為正向引物。測序反應(yīng)體系為10 μl，包括PCR產(chǎn)物和測序引物各1 μl，Terminator Ready Reaction Mix 8 μl。采用3130xl型測序儀進(jìn)行電泳分析。將所測得基因序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已提交基因序列進(jìn)行比對，初步確定HAdV血清型。

1.2.4HAdV纖維蛋白基因測序 對六鄰體蛋白PCR擴(kuò)增陽性標(biāo)本進(jìn)行纖維蛋白的PCR擴(kuò)增和測序，其正向引物、反向引物見表1。PCR反應(yīng)體系與六鄰體蛋白相同。用上述方法經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到纖維蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，長度約為1 500 bp，無特異條帶，估測質(zhì)量濃度在30 ng/μl以上。采用1.2.3部分相同的純化和測序反應(yīng)進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果通過以74種HAdV原型作為參考，對六鄰體蛋白及纖維蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析 從GenBank獲取74種HAdV原型作為參考，其分型及登錄號包括C1(AF534906)、C2(NC_001405)、B3(NC_011203)、E4(NC_003266)、C5(AY339865)、C6(FJ349096)、B7(AC_000018)、D8(AB448767)、D9(AJ854486)、D10(AB695622)、B11(FJ597732.1)、A12(X73487)、D13(JN226747)、B14(AY803294)、D15(JN226748)、B16(AY601636)、D17(AF108105)、A18(GU191019)、D19(JQ326209)、D20(JN226749)、B21(AY601633)、D22(FJ404771)、D23(JN226750)、D24(JN226751)、D25(JN226752)、D26(EF153474)、D27(JN226753)、D28(FJ824826)、D29(JN226754)、D30(JN226755)、A31(AM749299)、D32(JN226756)、D33(JN226758)、B34(AY737797)、B35(NC_004001)、D36(GO384080)、D37(DQ900900)、D38(JN226759)、D39(JN226760)、F40(NC_001454)、F41(AB728839)、D42(JN226761)、D43(JN226762)、D44(JN226763)、D45(JN226764)、D46(AY875648)、D47(JN226757)、D48(EF153473)、D49(DQ393829)、B50(AY737798)、D51(JN226765)、G52(DQ923122)、D53(FJ169625)、D54(NC_012959)、B55(FJ643676)、D56(HM770721)、C57(HQ003817)、D58(HQ883276)、D59(JF799911)、D60(HQ007053)、A61(JF964962)、D62(JN162671)、D63(JN935766)、D64(EF121005)、D65(AP012285)、B66(JN860676)、D67(AP012302)、B68(JN860678)、D69(JN226748)、D70(KP641339)、D71(KF268207)、D72(KF268335)、B79(AY601636)、D81(AB765926)。采用MEGA7.0.26軟件對樣本的六鄰體蛋白及纖維蛋白序列進(jìn)行分析，并與74株HAdV原型進(jìn)行比對。采用最大似然比程序構(gòu)建纖維蛋白和六鄰體蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育樹；采用1 000個自引復(fù)制驗(yàn)證樹的可靠性，利用Kimura-2參數(shù)計(jì)算遺傳距離。

表1 7種人類腺病毒的纖維基因引物Table 1 Fiber gene primers for seven types of humanadenoviruses腺病毒種類引物序列(5'-3')擴(kuò)增片段長度(bp)A 正向引物:TTCCCAATCCCTACCCACCAT反向引物:AAAGGGGGAAAGGGAGGTAT1 918B 正向引物:TTCCCAATCCCTACCCACCAT反向引物:AAAGGGGGAAAGGGAGGTAT1 111C 正向引物:AGATTCCTCTTGTTCCTGCCC反向引物:TGGGAAGGGGGAGGCAAAAT1 891D 正向引物:GTCCACAATTTTCATTGTCTTCCCT反向引物:CATCTCAATCACCGACCCCC1 348E 正向引物:TGTCAAATTCCTCCTGTCCCTC反向引物:AAAGGTGGGTTGGCATGCAG1 352F、G 正向引物:AGGCGCAATCTTCGCATTTC反向引物:GGGGGAGGGAGATTAACGG1 745

考慮到HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37為腺病毒性結(jié)膜炎，尤其是流行性角結(jié)膜炎的重要病原體，因此，HAdV和非HAdV分別構(gòu)建發(fā)育樹，以方便圖形展示。在非HAdV構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，將HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37原型序列作為HAdV-D的代表性序列，以展示HAdV-D與其他腺病毒序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 HAdV的分型與臨床表現(xiàn)

89例患者樣本可擴(kuò)增得到約3 000 bp的清晰條帶，占34.8%，表明此89例樣本中含有HAdV DNA。將六鄰體蛋白基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定此89例患者中HAdV-C1 1例、HAdV-C2 7例、HAdV-B3 20例、HAdV-E4 6例、HAdV-D8 23例、HAdV-D19 17例、HAdV-D37 15例，分別占1.12%、7.87%、22.47%、6.74%、25.84%、19.10%和16.85%。

HAdV-C1和HAdV-C2患者均表現(xiàn)為單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎。HAdV-B3患者伴耳前淋巴結(jié)腫大壓痛、上呼吸道感染、輕度角膜上皮浸潤者分別為13、10和5例，HAdV-E4患者伴上述改變者分別為3、4和1例。伴輕度角膜上皮浸潤的HAdV-B3和HAdV-E4患者均未發(fā)展為淺基質(zhì)層白色病灶。HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37患者伴耳前淋巴結(jié)腫大壓痛者分別有15、10和8例，伴結(jié)膜偽膜者分別有6、4和3例，伴輕度角膜上皮浸潤者分別有13、8和8例，伴淺基質(zhì)層白色病灶者分別有7、4和3例(表2)。

2.2 HAdV系統(tǒng)發(fā)育分析

在六鄰體蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析中，此89例患者序列均與相應(yīng)參考序列原型聚集。除2例HAdV-D8樣本與參考序列間遺傳距離為0.04和0.01外，其余樣本與原型間遺傳距離皆小于0.001(圖1，2)。

進(jìn)一步纖維蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，HAdV-D19和HAdV-D37的參考序列接近，遺傳距離<0.01，二者樣本存在交叉聚集，1例HAdV-D37樣本與HAdV-D19參考序列原型聚集，15例HAdV-D19樣本與HAdV-D37參考序列原型聚集，其余樣本，包括HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-B3、HAdV-E4和HAdV-D8均與相應(yīng)的參考序列原型聚集(圖1，2)。纖維蛋白聚集情況不同的HAdV-D19和HAdV-D37陽性病例臨床體征占比差別不明顯。

六鄰體蛋白系統(tǒng)發(fā)育組間比較提示，以HAdV-D六鄰體蛋白序列為參考，HAdV-B和HAdV-E遺傳距離較短，其次為HAdV-C。HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G六鄰體蛋白遺傳距離較遠(yuǎn)。纖維蛋白系統(tǒng)發(fā)育組間比較提示，以HAdV-D六鄰體蛋白序列為參考，HAdV-C遺傳距離最短，其次為HAdV-E和HAdV-B。HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G纖維蛋白遺傳距離同樣較遠(yuǎn)。

表2 不同HAdV分型臨床體征例數(shù)及所占比例[n(%)]Table 2 Cases and the ratio of different HAdv genotypes with various clinical manifestations (n[%])HAdV分型上呼吸道感染耳前淋巴結(jié)腫大壓痛結(jié)膜偽膜角膜上皮浸潤陰性陽性陰性陽性陰性陽性陰性輕度上皮浸潤淺基質(zhì)層病灶總例數(shù)HAdV-C11(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)1(100.00)0(0.00)0(0.00)1HAdV-C27(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)7(100.00)0(0.00)0(0.00)7HAdV-B310(50.00)10(50.00)7(35.00)13(65.00)20(100.00)0(0.00)15(75.00)5(25.00)0(0.00)20HAdV-E42(33.33)4(66.67)3(50.00)3(50.00)6(100.00)0(0.00)5(83.33)1(16.67)0(0.00)6HAdV-D823(100.00)0(0.00)10(43.48)13(56.52)17(73.91)6(26.09)5(21.74)11(47.83)7(30.43)23HAdV-D1917(100.00)0(0.00)7(41.18)10(58.82)13(76.47)4(23.53)5(29.41)8(47.06)4(23.53)17HAdV-D3715(100.00)0(0.00)7(46.67)8(53.33)12(80.00)3(20.00)3(20.00)8(53.33)4(26.67)15注:HAdV:人類腺病毒Note:HAdV:human adenovirus

圖1 HAdV-D腺病毒陽性樣本序列及腺病毒參考序列在六鄰體基因和纖維基因的系統(tǒng)發(fā)育樹 A：六鄰體蛋白基因 B：纖維蛋白基因 HAdV：人類腺病毒Figure 1 Phylogenetic tree of HAdV-D positives and HAdV reference strains in hexon gene and fiber gene A:hexon gene B:fiber gene HAdV:human adenovirus

圖2 非HAdV-D腺病毒陽性樣本序列及腺病毒參考序列在六鄰體基因和纖維基因的系統(tǒng)發(fā)育樹 A：六鄰體蛋白基因 B：纖維蛋白基因 HAdV：人類腺病毒Figure 2 Phylogenetic tree of non-HAdV-D positive samples and HAdV reference strains in hexon gene and fiber gene A：hexon gene B：fiber gene HAdV:human adenovirus

3 討論

HAdV屬于腺病毒科的哺乳動物腺病毒屬，為無包膜雙鏈DNA病毒，直徑為65～80 nm，由1個二十面體形狀的蛋白質(zhì)衣殼組成，包括252個殼粒、含DNA病毒基因組的核蛋白核心和內(nèi)部蛋白質(zhì)。HAdV已鑒定出70余種分型，分為HAdV-A～G 7種，可引起人體多種組織感染，包括結(jié)膜炎、胃腸炎、肝炎、心肌炎和肺炎等。腺病毒性結(jié)膜炎主要通過手眼接觸、眼分泌物以及與眼科護(hù)理人員及醫(yī)療器械的接觸傳播[4]。

HAdV分型與臨床分型高度相關(guān)。EKC是腺病毒性結(jié)膜炎中最嚴(yán)重的表現(xiàn)，主要由HAdV-D引起，HAdV-D8、HAdV-D19和HAdV-D37較常見，還包括HAdV-D54、HAdV-D56等[5-8]，一般病程持續(xù)約3周，表現(xiàn)為水樣分泌物、結(jié)膜充血、結(jié)膜偽膜、角膜浸潤、瞼球粘連和同側(cè)淋巴結(jié)腫大，部分角膜斑翳可能會殘存數(shù)年[1,9]；PCF表現(xiàn)為突然發(fā)熱、咽炎、雙側(cè)結(jié)膜炎和耳周淋巴結(jié)腫大，常由HAdV-B引起，包括HAdV-B3、HAdV-B5、HAdV-B7和HAdV-B11等[10]；單純?yōu)V泡性結(jié)膜炎僅表現(xiàn)為結(jié)膜濾泡，無角膜或全身受累，HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D和HAdV-E均可引起，包括HAdV-B3、HAdV-B7、HAdV-B11、HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-C5、HAdV-C6、HAdV-D8、HAdV-D9、HAdV-D10和HAdV-E4等。HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D和HAdV-E較易引起腺病毒性結(jié)膜炎，這與其在六鄰體蛋白及纖維蛋白上存在較近的遺傳距離有關(guān)。同樣，在六鄰體蛋白和纖維蛋白結(jié)構(gòu)上遺傳距離較大的HAdV-A、HAdV-F和HAdV-G，則較少引起腺病毒性結(jié)膜炎。

快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的HAdV檢測和分型可以為腺病毒性結(jié)膜炎的確診和進(jìn)一步臨床分型提供重要依據(jù)，為療效的預(yù)判、個性化用藥選擇、減少抗生素濫用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[11-12]。大多數(shù)腺病毒性結(jié)膜炎為自限性，輕癥者不需要治療，或僅需要使用人工淚液等支持性治療緩解癥狀，清潔眼表；嚴(yán)重病例需要局部使用糖皮質(zhì)激素滴眼液減少角膜斑翳、結(jié)膜偽膜和瞼球粘連[13]，甚至可能需行準(zhǔn)分子激光手術(shù)切削嚴(yán)重的角膜斑翳[14-15]。但單純依靠癥狀和體征的腺病毒性結(jié)膜炎的臨床診斷準(zhǔn)確率低于50%，缺乏快速、準(zhǔn)確的診斷方法使很多腺病毒性結(jié)膜炎被誤診為細(xì)菌性結(jié)膜炎，造成不必要的抗生素使用[2]。

PCR檢測結(jié)膜標(biāo)本中的HAdV基因以及進(jìn)一步的基因測序已經(jīng)替代細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合免疫熒光，成為HAdV檢測的常用方法[16]。六鄰體蛋白是目前HAdV分型最重要和常用的依據(jù)，其在所有血清型中都保留了抗原決定簇，能夠檢測幾乎全部的HAdV分型?；诹忬w蛋白的快速抗原檢測試劑盒已得到美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)，用于臨床HAdV分型。六鄰體蛋白基因位于HAdV基因組中部，相對保守，可以通過1對通用引物擴(kuò)增不同種的HAdV。但是，單純的六鄰體蛋白基因分析僅能得到HAdV分型的初步依據(jù)，而不能取代基因組或蛋白組測序帶來的完整生物學(xué)信息。

纖維蛋白是HAdV區(qū)別于其他二十面體病毒的特有蛋白，相關(guān)序列變化帶來的空間構(gòu)像變化與HAdV致病力的進(jìn)化有關(guān)[17]。纖維蛋白基因位于HAdV基因組尾部，在各種HAdV中變異較大，各種HAdV需要設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增和測序，可以識別宿主細(xì)胞表面的柯薩奇/HAdV受體，促使HAdV顆粒與宿主細(xì)胞鏈接并錨定，在HAdV的內(nèi)吞過程中起到重要作用。但是，部分類型的HAdV具有近似的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，因此，單純針對纖維蛋白的基因測序不能有效進(jìn)行HAdV分型，例如，HAdV-D19與HAdV-D37纖維蛋白結(jié)構(gòu)高度相似，本研究中也出現(xiàn)了HAdV-D19和HAdV-D37樣本與參考序列原型互相交叉聚集的現(xiàn)象。纖維蛋白與六鄰體蛋白的聯(lián)合基因測序可以更加有效地確定HAdV分型，并進(jìn)行進(jìn)一步的毒力分析。然而，本研究中存在交叉聚集的HAdV-D19與HAdV-D37樣本在臨床表現(xiàn)占比上無明顯差異。一方面可能是因?yàn)镠AdV-D19與HAdV-D37纖維蛋白結(jié)構(gòu)差異較小，另一方面可能是因?yàn)闃颖玖坑邢蕖５珜w維蛋白結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析仍是腺病毒致病力分析的重要方法之一。

在HAdV-D53之后出現(xiàn)了大量由現(xiàn)有HAdV的基因組變異、替換和重組發(fā)展出的新的基因組類型。通過五鄰體蛋白(P)、六鄰體蛋白(H)和纖維蛋白(F)標(biāo)記和命名這些新型HAdV已經(jīng)成為國際通用的方法，如HAdV-D53(P37H22F8)、HAdV-D59(P64H25F56)、HAdV-C57(P1H57F6)、HAdV-D58(P58H58F29)和HAdV-D63(P30H30F29)等。這些新型的HAdV也可能引起腺病毒性結(jié)膜炎，甚至可能引起EKC爆發(fā)，并日益成為EKC流行的重要血清型[8,18-21]。如果僅通過單個基因的測序分析，這些新型的HAdV可能會被錯誤地鑒定為傳統(tǒng)的HAdV，而雙基因，甚至三基因的聯(lián)合測序可以有效鑒定出新型HAdV。

相比于單純的基因測序和比對，系統(tǒng)發(fā)育分析為HAdV分類和分子進(jìn)化監(jiān)測提供了一種更加有效、可靠的方法。系統(tǒng)發(fā)育分析提示，HAdV-D與HAdV-B、HAdV-C、HAdV-E的親緣關(guān)系更近，而與HAdV-A、和HAdV-F的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可以從側(cè)面解釋HAdV-D、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-E容易引起眼部感染，而HAdV-A和HAdV-F引起眼部感染的可能性較小。

六鄰體蛋白基因和纖維蛋白基因位于HAdV基因組中部和尾部，變異程度較大，是進(jìn)行HAdV分型、變異研究和毒力分析的重要靶點(diǎn)[22]。本研究選用六鄰體蛋白基因和纖維蛋白基因的聯(lián)合測序，可以涵蓋HAdV基因組中近80%的變異，相對于全基因組測序更加快速、有效、易推廣，也比針對單一的六鄰體蛋白或纖維蛋白測序更加可靠，并且可能發(fā)現(xiàn)由基因變異、替換和重組發(fā)展出的新型HAdV。本研究方法在所得數(shù)據(jù)豐度上遜于全基因組測序，但種系分析能夠比單純的序列比對提供更豐富的病毒進(jìn)化和發(fā)展信息?？傊忬w蛋白基因和纖維蛋白基因的聯(lián)合測序可能為臨床預(yù)后判斷、減少角膜病損的發(fā)生及個性化治療方法的選擇提供豐富的分型和毒力分析信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明王旌：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫和修改；朱劍鋒、陸麗娜：分析數(shù)據(jù)、論文修改及定稿