元佳佳 張勇 陳長(zhǎng)征 楊雪瑩 繆青梅 Kai Yoon Fan 李斌,

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科，武漢 430065；2十堰市太和醫(yī)院眼科 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，十堰 442000；3武漢紐福斯生物科技有限公司，武漢 420200

Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一種罕見(jiàn)的由線粒體DNA點(diǎn)突變引起的母系遺傳病[1]，主要臨床表現(xiàn)為急性或亞急性、同時(shí)或先后雙眼視力下降至0.1以下甚至光感、視野敏感度下降及中心視野缺損。LHON常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)是還原型輔酶Ⅰ脫氫酶4(NADH dehydrogenase subunit 4，ND4)基因的11778(G>A)位點(diǎn)，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)能量代謝中的呼吸鏈結(jié)構(gòu)和功能受損、三磷酸腺苷生成受阻、細(xì)胞代謝過(guò)程能量缺乏和氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致RGCs凋亡及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)萎縮變薄，患眼視功能明顯受損[2-4]。視力下降和視野缺損是LHON主要的視功能改變表現(xiàn)，RNFL的變化則是LHON顯著的視網(wǎng)膜神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)改變[5-6]。按照國(guó)際臨床分期標(biāo)準(zhǔn)可將LHON分為4期，其中0期為無(wú)癥狀期(突變攜帶者)；1期為亞急性期，主要在發(fā)病后6個(gè)月；2期為動(dòng)態(tài)變化期，主要在發(fā)病后6～12個(gè)月；3期為慢性期，主要在發(fā)病后12個(gè)月以上[7]。本課題組前期對(duì)LHON不同分期的RNFL厚度特征研究發(fā)現(xiàn)，RNFL在急性期水腫逐漸加重，在慢性期和平臺(tái)期視神經(jīng)萎縮，RNFL變薄情況逐漸穩(wěn)定[6]。目前關(guān)于基因治療前后視功能恢復(fù)與RNFL厚度之間的關(guān)聯(lián)研究較少，其對(duì)治療后臨床療效的判定以及了解影響視力和視野恢復(fù)的因素至關(guān)重要?，F(xiàn)階段，LHON尚無(wú)確定有效的治療方法。近年來(lái)LHON的基因治療研究受到廣泛關(guān)注并得到快速發(fā)展，國(guó)際上相關(guān)的臨床研究工作逐漸開(kāi)展[8-10]。本研究團(tuán)隊(duì)在2017年12月27日也啟動(dòng)了LHON基因治療的臨床研究，并首先在國(guó)內(nèi)外報(bào)道了我國(guó)的相關(guān)臨床研究結(jié)果[11-13]。但中國(guó)的相關(guān)臨床研究仍屬于起步階段，基因治療效果仍缺乏主要研究證據(jù)，尤其是患者基因治療后視功能恢復(fù)與視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)分析。本研究進(jìn)一步探索LHON基因治療后視力和視野恢復(fù)情況與RNFL厚度之間的關(guān)聯(lián)，為基因治療LHON臨床療效的判定以及治療方案的優(yōu)化提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用開(kāi)放標(biāo)簽、單臂多中心臨床試驗(yàn)方法，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院、十堰市太和醫(yī)院、武漢大學(xué)附屬鄂州市中心醫(yī)院、武漢大學(xué)人民醫(yī)院以及阿根廷布宜諾斯艾利斯的佩德羅·拉格萊澤眼科醫(yī)院臨床醫(yī)生共同開(kāi)展相關(guān)研究，于2017年12月至2018年12月共招募LHON患者159例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過(guò)基因檢測(cè)確診為m11778G-A/MT-ND4突變的LHON患者；(2)年齡10～60歲；(3)最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)(小數(shù)視力)<0.3；(4)全身狀況可以耐受一系列眼科檢查及治療，并能按時(shí)隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在可能影響視神經(jīng)相關(guān)視功能的其他眼部疾病，如青光眼、視神經(jīng)疾病或全身性疾病；(2)基因治療前6個(gè)月內(nèi)使用過(guò)可能影響研究準(zhǔn)確性的藥物，如艾地苯醌、維生素、抗氧化劑或中藥；(3)治療前1年自然病程觀察期間出現(xiàn)視力自發(fā)性提高的患者。159例LHON患者中男143例，女16例，包括來(lái)自阿根廷的白人男性患者10例(所有患者均為雙眼患病)?；颊吣挲g6～45歲，平均(19.2±7.2)歲；病程3～312個(gè)月。本研究方案由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院(批文號(hào)：TJ-IRB20180316)、十堰市太和醫(yī)院(批文號(hào)：2017-01)、鄂州市中心醫(yī)院(批文號(hào)：2017-K-05)和武漢大學(xué)人民醫(yī)院(批文號(hào)：WDRY2020-K202)倫理委員會(huì)根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行審查和批準(zhǔn)，研究實(shí)施前經(jīng)Clinical Trials.gov進(jìn)行臨床試驗(yàn)注冊(cè)。所有患者或授權(quán)監(jiān)護(hù)人均充分了解與本研究相關(guān)的醫(yī)療診療過(guò)程和方案以及研究目的，并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1玻璃體腔注射 采用重組腺相關(guān)病毒2-ND4(recombinant adeno associated virus 2-ND4，rAAV2-ND4)(攜帶NADH-泛醌氧化還原酶亞基4基因的重組腺相關(guān)病毒)(武漢紐福斯生物科技有限公司)0.05 ml單眼玻璃體腔注射法進(jìn)行治療，藥物注射眼選擇BCVA較差眼，若雙眼視力相同，則選擇右眼為注射眼。玻璃體腔注射在手術(shù)室進(jìn)行，患者取平臥位，術(shù)眼采用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼3次；常規(guī)消毒鋪巾，行面部及眼部消毒；術(shù)眼用開(kāi)瞼器開(kāi)瞼，體積分?jǐn)?shù)0.5%聚維酮碘消毒液沖洗結(jié)膜囊，10 s后用生理鹽水沖洗；用1 ml注射器吸取0.05 ml rAAV 2-ND4(1.0×1010vg)，于注射眼順時(shí)針7：00～8：00位角膜緣后4 mm處進(jìn)針，緩慢推注藥物，拔出針頭后無(wú)菌棉簽按壓注射點(diǎn)2 min；術(shù)眼涂抗生素眼膏，包扎術(shù)眼?；颊咂脚P30 min后返回病房。手術(shù)操作均由同一有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行。

1.2.2眼科檢查 所有入組患者在基因治療前隨訪至少1年，在治療前及治療后1、3、6、12個(gè)月均分別由同一醫(yī)師行BCVA、視野和RNFL厚度檢查，檢查者不知注射眼和非注射眼。

1.2.2.1BCVA檢查 采用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)視力表(溫州星康醫(yī)療技術(shù)有限公司)檢查患者視力，受檢眼與視力表距離為2.5 m，分別測(cè)定雙眼視力，將BCVA轉(zhuǎn)換成LogMAR視力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以術(shù)前末次隨訪BCVA作為基線視力。

1.2.2.2視野檢查 采用Humphrey自動(dòng)視野計(jì)(740i，德國(guó)Carl Zeiss公司)30-2中心閾值測(cè)試和SITA快速檢測(cè)模式分別測(cè)定患者雙眼視野。

1.2.2.3RNFL厚度測(cè)量 采用Spectralis?HRA+OCT(德國(guó)Heidelberg公司)Glaucoma-ONH模式測(cè)定視盤(pán)上方、下方、顳側(cè)、鼻側(cè)和平均RNFL厚度，從內(nèi)界膜層到光感受器細(xì)胞層。

1.2.3終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo) 主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為術(shù)后視力、視野和RNFL厚度變化。(1)視力變化 以注射后第12個(gè)月BCVA改善情況作為治療后的視力結(jié)局，視力改善定義為BCVA提高≥0.3，視力未改善定義為BCVA提高<0.3。根據(jù)注射后第12個(gè)月BCVA改善情況將患者分為注射眼視力改善組81眼、注射眼視力未改善組62眼、未注射眼視力改善組65眼和未注射眼視力未改善組78眼。(2)視野變化 以注射后第12個(gè)月的視野改善情況作為視野結(jié)局，以視野指數(shù)(visual field index，VFI)提高10%和平均偏差(mean deviation，MD)提高3 db作為改善標(biāo)準(zhǔn)，分別將患者分為注射眼VFI改善組48眼、注射眼VFI未改善組71眼、未注射眼VFI改善組47眼、未注射眼VFI未改善組72眼，以及注射眼MD改善組52眼、注射眼MD未改善組67眼、未注射眼MD改善組47眼、未注射眼MD未改善組72眼。(3)RNFL動(dòng)態(tài)變化 于注射后第1、3、6、12個(gè)月進(jìn)行隨訪，觀察注射后不同時(shí)間點(diǎn)注射眼和未注射眼RNFL變化。(4)患者治療后12個(gè)月視功能各指標(biāo)與RNFL的關(guān)系評(píng)估。

表2 患者治療前后視野相關(guān)指標(biāo)比較(x±s)Table 2 Comparison of perimetry indicators among patients between beforeand after treatment (x±s)時(shí)間眼數(shù)VFI(%)注射眼未注射眼MD(dB)注射眼未注射眼治療前15924.84±21.6729.73±25.69-25.00±7.54-23.31±9.32治療后15933.98±27.2737.25±27.83-21.66±9.17-20.86±9.30t值-4.451-3.352-5.110-2.745P值<0.0010.001<0.0010.007注:(配對(duì)t檢驗(yàn)) VFI:視野指數(shù);MD:平均偏差Note:(Paired t test) VFI:visual field index;MD:mean deviation

表3 患者治療前后不同時(shí)間點(diǎn)不同部位RNFL厚度比較(x±s,μm)Table 3 Comparison of RNFL thickness among patients at different timepoints (x±s,μm)時(shí)間眼數(shù)注射眼不同部位RNFL厚度上方下方顳側(cè)鼻側(cè)平均治療前15375±3870±3635±1837±1957±38治療后1個(gè)月14070±3066±2831±832±1650±18治療后3個(gè)月12166±2462±2130±730±1647±14治療后6個(gè)月11162±1860±1530±730±1445±10治療后12個(gè)月12258±1556±1229±628±1242±9F值28.29022.93010.01023.68014.990P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001時(shí)間眼數(shù)未注射眼不同部位RNFL厚度上方下方顳側(cè)鼻側(cè)平均治療前15378±3873±3736±1937±2056±26治療后1個(gè)月14073±3568±3132±1333±1751±22治療后3個(gè)月12168±3163±2430±931±1748±18治療后6個(gè)月11164±2560±1930±1029±1446±18治療后12個(gè)月12260±1856±1429±628±1243±9F值25.83024.21011.17025.25028.130P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001注:(廣義線性混合模型) RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層Note:(Generalized linear mixed model) RNFL:retinal nerve fiber layer

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 視力改善者治療前后BCVA比較

共91例患者治療后12個(gè)月BCVA改善，占57.23%(包括注射眼和未注射眼)。治療后注射眼BCVA較治療前平均提高0.31±0.40，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.920，P<0.001)；未注射眼BCVA較治療前平均提高0.23±0.46，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.550，P<0.001)(表1)。

2.2 治療前后視野相關(guān)指標(biāo)變化比較

治療后12個(gè)月，注射眼和未注射眼VFI均明顯增加，MD較治療前均有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.451、-5.110，均P<0.001)；未注射眼VFI較治療前均明顯增加，MD較治療前均有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.352、-2.745，均P<0.01)(表2)。

2.3 治療前后患者RNFL厚度變化比較

治療前及治療后第1、3、6、12個(gè)月RNFL厚度見(jiàn)表3，治療后RNFL厚度總體逐漸變薄。治療前后注射眼與未注射眼不同部位的RNFL厚度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。

表1 視力改善者治療前后BCVA比較(x±s,LogMAR視力)Table 1 Comparison of BCVA between before and aftertreatment among patients with visual improvement(x±s,LogMAR visual acuity)時(shí)間眼數(shù)注射眼未注射眼治療前1591.70±0.411.53±0.51治療后12個(gè)月1591.37±0.551.29±0.59t值4.9203.550P值<0.001<0.001注:(配對(duì)t檢驗(yàn)) BCVA:最佳矯正視力Note:(Paired t test) BCVA:best corrected visual acuity

表4 各組BCVA與不同部位RNFL厚度相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between BCVA and RNFL thickness in four groups組別上方下方顳側(cè)鼻側(cè)平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼視力提高組-0.3620.003-0.2920.0190.2310.066-0.3070.014-0.3080.013注射眼視力未提高組0.0660.003-0.2230.0991.0000.341-0.2640.002-0.2790.001未注射眼視力提高組-0.1220.398-0.1110.443-0.0550.702-0.1870.194-0.1870.193未注射眼視力未提高組-0.2500.035-0.1720.150-0.1030.392-0.1410.240-0.2320.052注:(Pearson相關(guān)分析) BCVA:最佳矯正視力;RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層Note:(Pearson correlation analysis) BCVA:best corrected visual acuity;RNFL:retinal nerve fiber layer

表5 各組VFI與不同部位RNFL厚度相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between VFI and RNFL thickness in four groups組別上方下方顳側(cè)鼻側(cè)平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼VFI提高組0.4390.0010.3560.011-0.0290.8440.2940.0380.4010.004注射眼VFI未提高組0.3010.0200.2760.033-0.1790.1720.3390.0080.3660.004未注射眼VFI提高組0.5800.0010.5240.001-0.1540.2950.5700.0010.6430.001未注射眼VFI未提高組0.2270.0790.2230.084-0.2350.0680.1310.3150.2490.053注:(Pearson相關(guān)分析) VFI:視野指數(shù);RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層Note:(Pearson correlation analysis) VFI:visual field index;RNFL:retinal nerve fiber layer

表6 各組MD與不同部位RNFL厚度相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between MD and RNFL in four groups組別上方下方顳側(cè)鼻側(cè)平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼MD提高組0.4950.0010.4240.002-0.0710.6220.3770.0070.4740.001注射眼MD未提高組0.3140.0140.2920.023-0.1850.1560.3330.0090.3770.003未注射眼MD提高組0.6010.0010.6010.001-0.1450.3270.5730.0010.6650.001未注射眼MD未提高組0.2480.0540.2430.059-0.2150.0960.1680.1950.2800.029注:(Pearson相關(guān)分析) MD:平均缺損值;RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層Note:(Pearson correlation analysis) MD:mean deviation;RNFL:retinal nerve fiber layer

2.4 治療后患者BCVA與RNFL厚度相關(guān)性分析

注射眼視力提高組BCVA與視網(wǎng)膜上方、下方、鼻側(cè)、平均RNFL厚度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.362、-0.292、-0.307、-0.308，均P<0.05)；注射眼視力未提高組BCVA與上方RNFL厚度呈正相關(guān)(r=0.066，P=0.003)，與鼻側(cè)、平均RNFL厚度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.264、-0.279，均P<0.05)。除未注射眼視力未提高組BCVA與視網(wǎng)膜上方RNFL呈負(fù)相關(guān)(r=-0.250,P=0.035)外，未注射眼視力提高組和未注射眼視力未提高組BCVA與其余不同部位RNFL厚度均無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)(表4)。

2.5 治療后患者VFI、MD與RNFL厚度相關(guān)性分析

注射眼VFI提高組、注射眼VFI未提高組和未注射眼VFI提高組VFI與上方、下方、鼻側(cè)、平均RNFL厚度均呈正相關(guān)(注射眼VFI提高組：r=0.439、0.356、0.294、0.401，均P<0.05；注射眼VFI未提高組：r=0.301、0.276、0.339、0.366，均P<0.05；未注射眼VFI提高組：r=0.580、0.524、0.570、0.643，均P<0.05)。未注射眼VFI未提高組VFI與RNFL厚度均無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)(表5)。

注射眼MD提高組、注射眼MD未提高組和未注射眼MD提高組MD與上方、下方、鼻側(cè)、平均RNFL厚度均呈正相關(guān)(注射眼MD提高組：r=0.495、0.424、0.377、0.474，均P<0.05；注射眼MD未提高組：r=0.314、0.292、0.333、0.377，均P<0.05；未注射眼MD提高組：r=0.601、0.601、0.573、0.665，均P<0.05)。未注射眼MD未提高組MD與平均RNFL厚度呈正相關(guān)(r=0.280，P<0.05)(表6)。

3 討論

本研究團(tuán)隊(duì)于2011—2012年開(kāi)展了第1次基因治療LHON的臨床試驗(yàn)，并對(duì)9例患者術(shù)后與術(shù)前的視野改善情況進(jìn)行了分析，9例患者完成術(shù)后90個(gè)月的臨床隨訪，有6例患者視力持續(xù)提高，顯示了基因治療的長(zhǎng)期有效性[14-17]。團(tuán)隊(duì)于2017年12月開(kāi)展了第2次基因治療的臨床研究，共治療了159例LHON患者，部分患者視力未提高，除年齡、病程和治療前基線BCVA外，發(fā)現(xiàn)視力和視野的改善與基因治療后的RNFL厚度存在一定的相關(guān)性[11,13]。本研究結(jié)果顯示，基因治療后注射眼視力提高組BCVA、VFI和MD與RNFL厚度呈正相關(guān)，基因治療后RNFL越厚，視力和視野預(yù)后越好，這從側(cè)面反映出基因治療LHON的效果，基因治療可以延緩視神經(jīng)萎縮，保留或提高現(xiàn)有視力?；蛑委熀蟮呐R床隨訪對(duì)分析基因治療的相關(guān)性因素非常重要。

中心視力代表黃斑乳頭束的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜功能，視野直接反映的是除黃斑乳頭束之外的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜功能。視神經(jīng)結(jié)構(gòu)決定了LHON患者的BCVA和視野，基因突變導(dǎo)致的線粒體功能障礙可引發(fā)視神經(jīng)厚度發(fā)生變化[6]。LHON患者最先出現(xiàn)BCVA急性降低，中心視野缺失，然后逐漸向外周擴(kuò)大，其視野缺失遵循視神經(jīng)丟失規(guī)律[18]。無(wú)癥狀期、急性期顳側(cè)和下方象限RNFL增厚，隨疾病進(jìn)展，顳側(cè)象限的RNFL逐漸變薄。慢性期視盤(pán)上方、鼻側(cè)、下方象限的RNFL也逐漸變薄，一般在發(fā)病后1年達(dá)到穩(wěn)定[19]。

基因治療LHON的原理是rAAV2攜帶正常ND4基因在RGCs表達(dá)，在線粒體中轉(zhuǎn)錄翻譯正常的ND4蛋白，從而能夠源源不斷地給RGCs補(bǔ)充所需要的能量，防止其缺乏能量而發(fā)生進(jìn)一步萎縮?；蛑委熀笠曇盎謴?fù)與視神經(jīng)損傷的方向相反，損傷較輕的視神經(jīng)治療后先恢復(fù)。

本研究顯示注射眼視力提高與上方、下方、鼻側(cè)和平均RNFL厚度均呈負(fù)相關(guān)，與顳側(cè)RNFL厚度無(wú)明顯相關(guān)性，這與我們認(rèn)識(shí)中的黃斑乳頭束RNFL厚度決定視力的觀念并不一致，值得深入探討。由于單眼注射的原則是治療視力較差眼，如果雙眼視力相同，則治療右眼，而且治療前注射眼的RNFL厚度較未注射眼偏薄，因此本研究結(jié)果可進(jìn)一步說(shuō)明基因治療對(duì)視神經(jīng)的保護(hù)作用。由于目前臨床上缺乏針對(duì)RGCs形態(tài)和凋亡情況的詳細(xì)檢測(cè)方法，不能更加直觀地檢測(cè)視神經(jīng)結(jié)構(gòu)與視功能的關(guān)系，因此仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明元佳佳：參與選題、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；張勇、陳長(zhǎng)征：參與選題、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)；楊雪瑩、繆青梅：實(shí)施研究、收集數(shù)據(jù)、資料分析和解釋；Kai Yoon Fan：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及修改文章；李斌：參與選題和試驗(yàn)設(shè)計(jì)、對(duì)文章知識(shí)性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿