蔡素萍 張達人 羅小玲 黃龍翔 王婷婷 許婷婷 劉旭陽,

1暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院，深圳 518040；2廈門大學附屬廈門眼科中心，廈門 361016；3深圳市人民醫(yī)院眼科 暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳 518020；4福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科，福州 350005；5四川大學華西廈門醫(yī)院眼科，廈門 361021

Wagner綜合征是一種少見的遺傳性玻璃體視網(wǎng)膜疾病，以玻璃體空腔，玻璃體腔內(nèi)條帶狀、膜狀或網(wǎng)紗狀增生牽引為主要臨床表現(xiàn)，可繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離、脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮、進行性夜盲、近視及早發(fā)白內(nèi)障，其中進行性脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮和繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離是引起視力嚴重下降的主要原因[1]。VCAN基因變異可引起Wagner綜合征，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。VCAN基因編碼的Versican蛋白是一種硫酸軟骨素蛋白聚糖，在胚胎發(fā)育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，說明其致病機制為VCAN基因功能缺失[2-3]。目前國內(nèi)尚未見Wagner綜合征病例及家系報道，本研究對中國漢族Wagner綜合征一家系的臨床表現(xiàn)及分子遺傳學特點進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

家系信息采集自廈門大學附屬廈門眼科中心和福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科。采用家系調(diào)查研究方法，于2020年1月在廈門大學附屬廈門眼科中心收集中國漢族Wagner綜合征一家系共3代13名成員，其中確診患者共5例。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)廈門大學附屬廈門眼科中心醫(yī)學倫理委員會批準(批文號：MR-35-22-002800)，所有受檢者均充分了解本研究目的并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1全身及眼科檢查 詳細詢問所有受試者病史，全身檢查包括口面部、骨骼、關節(jié)、肌肉及聽力檢查；眼科檢查包括裸眼視力和最佳矯正視力(國際標準視力表)、非接觸式眼壓計(TX-20，日本佳能公司)測量受試者眼壓，裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)情況，直接檢眼鏡、眼底照相(Visucam524，德國Carl Zeiss公司)、廣角眼底照相(歐寶200，德國歐寶公司)、光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)(AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，德國Carl Zeiss公司)檢查眼底情況，超聲生物顯微鏡(ultrasound biomicroscope，UBM)(法國光太公司)檢查眼前節(jié)及房角情況等，家系中已故成員病歷資料由其子女提供。

1.2.2分子遺傳學分析 基因檢測及分子遺傳學分析由暨南大學附屬深圳眼科醫(yī)院、深圳市人民醫(yī)院、四川大學華西廈門醫(yī)院共同完成。采用HaploPainter軟件繪制家系圖，并進行系譜分析。采集受試者2 ml外周靜脈血于EDTA抗凝管中，提取基因組DNA樣本后，由上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技公司對先證者DNA使用高通量目標區(qū)域捕獲測序進行檢測，芯片包含已知玻璃體視網(wǎng)膜疾病的386個基因，針對篩選出的變異位點，對該家系中其他家庭成員進行共分離驗證。采用美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南對變異位點進行評分，通過蛋白結(jié)構和功能預測網(wǎng)站PredictProtein(https://predictprotein.org)對VCAN結(jié)構和功能進行預測。

2 結(jié)果

2.1 Wagner家系遺傳方式及特點

該家系符合Wagner綜合征臨床診斷者共5例(表1)，各代均有發(fā)病，其中男3例，女2例，1例已去世，表型正常者8人。家系中無近親結(jié)婚史，且3代連續(xù)發(fā)??；男女患者發(fā)病概率無明顯差別；患者雙親中必有一方患?。蝗舾改鸽p方均未患病，所有子女均不患病。該家系遺傳模式符合常染色體顯性遺傳(圖1)。

表1 Wagner綜合征家系患者表現(xiàn)型分析Table 1 Phenotype analysis of patients from a Wagner syndrome family患者確診年齡(歲)視力(右眼/左眼)眼部主要表現(xiàn)是否手術突變位點類型Ⅱ-352均為手動/眼前早發(fā)白內(nèi)障、人工晶狀體脫位、玻璃體濃縮、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮,虹膜無前后粘連,無明顯色素脫失,無明顯房水閃輝,KP(-)是c.9265+1G>A雜合Ⅱ-551無光感/0.6早發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脫離及黃斑水腫是c.9265+1G>A雜合Ⅲ-1260.1/0.25前房淺(約1/4 CT)、視網(wǎng)膜面紗樣增生膜、色素沉著、視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮是c.9265+1G>A雜合Ⅲ-220未查前房淺(約1/4 CT)、眼底色素沉著否c.9265+1G>A雜合注:KP:角膜后沉著物;CT:角膜厚度Note:KP:keratic precipitate;CT:corneal thickness

圖1 Wagner綜合征家系圖 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先證者Figure 1 Pedigree of a Chinese family with Wagner syndrome □:normal male;○:normal female;■:affected male;●:affected female;/:deceased;:proband

2.2 Wagner綜合征家系患者表型特征

先證者Ⅱ-3，男，52歲，雙眼人工晶狀體脫位。先證者女兒Ⅲ-1自幼雙眼視力差，伴有夜盲，曾因雙眼急性閉角型青光眼(右眼急性發(fā)作期，左眼臨床前期)在當?shù)蒯t(yī)院行藥物降眼壓治療。先證者兒子Ⅲ-2夜間視力差，暫未出現(xiàn)其他眼部癥狀。該家系所有患者均無全身病史和全身異常表現(xiàn)，眼部病變具有以下特點：(1)前房淺(約1/4 CT)，有閉角型青光眼的發(fā)病趨勢。先證者及其胞弟Ⅱ-5已行白內(nèi)障手術，其前房狀況不能反映真實情況，先證者女兒Ⅲ-1和兒子Ⅲ-2雙眼前房淺(圖2)；(2)懸韌帶異常，玻璃體濃縮。先證者擴瞳后可見雙眼人工晶狀體向下方移位，上方懸韌帶稀疏，瞳孔區(qū)可見濃縮的玻璃體(圖3)；(3)白內(nèi)障發(fā)病年齡早。家系中先證者及其胞弟Ⅱ-5在約40歲時已有明顯白內(nèi)障，因二人均已行白內(nèi)障手術，故無影像學資料；(4)視網(wǎng)膜牽拉膜形成。先證者及其女Ⅲ-1眼底均可見明顯的視網(wǎng)膜面紗樣增生膜形成，先證者胞弟Ⅱ-5曾因視網(wǎng)膜脫離行手術治療，眼底可見增生膜形成，牽拉視網(wǎng)膜，引起神經(jīng)上皮脫離，黃斑水腫(圖4)；(5)視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮。先證者及其女Ⅲ-1眼后節(jié)OCT均可見明顯視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮變薄(圖5)；(6)眼底色素沉著。先證者及其胞弟Ⅱ-5、其女Ⅲ-1、其子Ⅲ-2雙眼底均可見不同程度色素沉著；(7)先證者瞳孔欠圓，但無葡萄膜炎病史，虹膜無前后粘連及明顯色素脫失，無明顯房水閃輝，KP(-)。

圖2 患者Ⅲ-1和Ⅲ-2雙眼眼前節(jié)照相 顯示雙眼前房淺 A：患者Ⅲ-1右眼 B：患者Ⅲ-1左眼 C：患者Ⅲ-2右眼 D：患者Ⅲ-2左眼 圖3 先證者Ⅱ-3左眼眼前節(jié)照相 A：人工晶狀體向下方移位 B：上方懸韌帶稀疏，瞳孔區(qū)可見濃縮的玻璃體機化膜Figure 2 Anterior segment images of both eyes of patients Ⅲ-1 and Ⅲ-2 Anterior chambers were shallow A:right eye of Ⅲ-1 B:left eye of Ⅲ-1 C:right eye of Ⅲ-2 D:left eye of Ⅲ-2 Figure 3 Photograph of the left anterior segment of the proband Ⅱ-3 A:The intraocular lens shifted downward B:The upper suspensory ligament was sparse,and the condensation of organized vitreous membrane was observed in pupil area

圖6 Wagner綜合征患者VCAN基因序列片段 該家系中所有患者VCAN基因上發(fā)現(xiàn)1個雜合經(jīng)典剪接位點變異c.9265+1G>A，如紅色方框及紅色箭頭所示Figure 6 VCAN gene sequence fragment of patients with Wagner syndrome A heterozygous canonical splicing site variant c.9265+1G>A was found in the VCAN gene of all patients in the family,as shown by the red box and red arrow

圖4 先證者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1彩色眼底照相 先證者及其女兒Ⅲ-1雙眼眼底均可見明顯的視網(wǎng)膜面紗樣增生膜(箭頭)形成及色素沉著；先證者胞弟Ⅱ-5左眼眼底可見增生膜(箭頭)形成及色素沉著 A：先證者右眼 B：先證者左眼 C：先證者女兒Ⅲ-1右眼 D：先證者女兒Ⅲ-1左眼 E：先證者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 4 Color fundus images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Obvious retinal veil-like proliferative membrane (arrow) was observed in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1,and pigmentation was seen in their fundus.The proliferative membrane (arrow) and pigmentation was observable in the fundus of the left eye of the proband's younger brother Ⅱ-5 A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

圖5 先證者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1黃斑OCT圖像 先證者及其女兒Ⅲ-1均可見雙眼視網(wǎng)膜及脈絡膜明顯萎縮變?。幌茸C者胞弟Ⅱ-5左眼眼底增生膜牽拉視網(wǎng)膜引起神經(jīng)上皮脫離及黃斑水腫 A：先證者右眼 B：先證者左眼 C：先證者女兒Ⅲ-1右眼 D：先證者女兒Ⅲ-1左眼 E：先證者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 5 Macular OCT images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Significant atrophy and thinning of the retina and choroid were seen in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1.Proliferative membrane was observed in the fundus of left eye of Ⅱ-5,the proband's younger brother,stretching the retina and causing neuroepithelial detachment and macular edema A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

2.3 基因測序

高通量目標區(qū)域捕獲測序和Sanger測序發(fā)現(xiàn)該家系中VCAN基因上的1個雜合經(jīng)典剪接位點變異c.9265+1G>A，該變異與疾病共分離(圖6)。該變異為罕見變異，目前已有文獻報道在Wagner綜合征型玻璃體視網(wǎng)膜病變患者中檢測到該變異，相關信息已被收錄在人類基因突變數(shù)據(jù)庫和Clinvar數(shù)據(jù)庫中，在千人基因組、ExAC、gnomAD數(shù)據(jù)庫中均未收錄該變異，ACMG評級為PM2。該變異為經(jīng)典剪接變異，可能導致該基因的功能缺失，ACMG評級為PVS1。參照ACMG指南，該變異為可能致病性變異。該變異位于剪切位點，通過蛋白質(zhì)功能預測，其堿基對取代可引起截短1 754個氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物形成，導致單倍體劑量不足，糖胺聚糖附著位點嚴重減少，使Versican蛋白功能出現(xiàn)異常。

3 討論

本研究中通過對家系成員詳細的臨床檢查發(fā)現(xiàn)，該Wagner綜合征家系的眼部病變共同特征包括懸韌帶異常、早發(fā)白內(nèi)障、玻璃體空腔、玻璃體濃縮、玻璃體腔中面紗狀增生膜、視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮變薄、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜色素沉著。先證者白內(nèi)障術后出現(xiàn)雙眼人工晶狀體脫位，部分患者還存在淺前房等閉角型青光眼的發(fā)病誘因。Wagner綜合征的癥狀通常在青春期出現(xiàn)，但也可以在幼年時期開始。除該家系所表現(xiàn)出的臨床特征外，有研究者報道部分Wagner綜合征患者還可出現(xiàn)因黃斑牽拉引起位移產(chǎn)生假性斜視外觀、小眼癥、虹膜萎縮和原始玻璃體持續(xù)增生等臨床表現(xiàn)[4-5]。

Stickler綜合征是一種結(jié)締組織疾病，其眼部特征與Wagner綜合征類似，都存在較典型的玻璃體凝膠結(jié)構異常和視網(wǎng)膜改變，不同的是，Wagner綜合征沒有全身系統(tǒng)性病變，而Stickler綜合征可合并關節(jié)、頜面部及聽力損傷等全身異常[6-7]。但常見的1型Stickler綜合征多數(shù)僅有眼部異常表現(xiàn)[8]，在臨床上不易與Wagner綜合征區(qū)分，需進一步行遺傳學檢查加以鑒別。Wagner綜合征與Stickler綜合征在遺傳學方面有明顯區(qū)別，前者是由于位于染色體5q的VCAN基因變異導致，幾乎完全外顯[9]，后者則由于位于染色體12q的膠原合成相關基因變異導致，遺傳方式也較為多樣，最常見的是由COL2A1基因變異引起[10]，還可見于COL11A1、COL11A2、COL9A1、COL9A2及COL9A3等基因[11-14]。Wagner綜合征還需與Jansen綜合征及侵蝕性玻璃體視網(wǎng)膜病變綜合征相鑒別。Jansen綜合征常見臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜脫離[15]，侵蝕性玻璃體視網(wǎng)膜病變除了與Wagner綜合征有相似的臨床表現(xiàn)外，由于脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮更明顯，可引起進行性夜盲和向心性視野縮窄[16]。

Wagner綜合征由VCAN基因變異引起。VCAN有15個外顯子，編碼一種具有3 396個氨基酸的大型硫酸軟骨素蛋白聚糖Versican。Versican蛋白在胚胎發(fā)育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，說明其致病機制為VCAN基因的功能缺失。Versican是一種細胞外基質(zhì)蛋白，是玻璃體的組成部分，參與維持玻璃體結(jié)構的完整性[17]。已知Versican的4種轉(zhuǎn)錄物/同工型蛋白質(zhì)分別是包含2個外顯子的V0(NM004385.4)、缺乏外顯子7的V1(NM001164097)、缺乏外顯子8的V2(NM001164098)和缺乏外顯子7及外顯子8的V3(NM001126336)[18]，由外顯子7和外顯子8的可變剪接產(chǎn)生，并且在許多組織中表達，其中包括眼組織[18-19]。這2個外顯子包含糖胺聚糖附著位點，可支持硫酸軟骨素側(cè)鏈聚集。糖胺聚糖殘基在翻譯后與外顯子7和外顯子8編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構域相連，這些殘基參與了玻璃體凝膠的形成[17]。迄今為止，所有已被報道的Wagner綜合征患者基因變異均影響了VCAN基因的保守內(nèi)含子7受體剪接位點或內(nèi)含子8的供體剪接位點[18,20-26]。

目前尚無研究表明Versican在晶狀體內(nèi)表達，但在多個不同VCAN變異位點的Wagner綜合征研究報道中均存在白內(nèi)障[1-3]，而在國外與本研究相同的c.9265+1G>A雜合突變家系中亦存在白內(nèi)障這一表型[25-26]，且該突變與表型共分離，因此可認為本研究中早發(fā)白內(nèi)障這一表型與VCAN變異密切相關。該家系基因分析并未發(fā)現(xiàn)與Wagner綜合征及早發(fā)白內(nèi)障這一表型共分離的其他變異位點。因此，目前尚無其他證據(jù)提示本病是由于其他基因變異引起的早發(fā)白內(nèi)障。然而，也不排除白內(nèi)障表型與VCAN基因相關其他基因變異有關的可能性，亦有可能由于玻璃體異常導致了繼發(fā)性晶狀體發(fā)育異常，值得深入研究。

目前雖然尚不能完全解釋Wagner綜合征的確切分子發(fā)病機制，但很明顯其涉及剪接。內(nèi)含子7剪接受體位點變異可以激活21個堿基對的隱蔽剪接位點，使其成為外顯子8的異常轉(zhuǎn)錄本[18,20,24]，有研究報道在攜帶c.9265+1G>A變異的Wagner綜合征患者的血液中能夠發(fā)現(xiàn)少量該異常轉(zhuǎn)錄本[21]。本研究首次在中國漢族一家系中確定了VCAN基因c.9265+1G>A變異是該Wagner綜合征分子遺傳學上的致病原因，定位在外顯子8側(cè)翼的保守剪接位點，并推斷該基因產(chǎn)生變異后持續(xù)降低剪接位點的作用強度，從而促進外顯子產(chǎn)生的同工型蛋白V2亞型增加。此前有研究表明，在剪接受體位點(c.4004-1、-2和-5)變異的Wagner綜合征患者V2表達可增加80倍，能夠進一步支持這一觀點[20,22]。V2蛋白具有相當數(shù)量的側(cè)鏈，因此，進一步探討V2蛋白側(cè)鏈的功能及相互作用有助于解釋該家系眼部表型的機制，如高發(fā)病率的視網(wǎng)膜脫離或容易引起視網(wǎng)膜脫離的周邊部視網(wǎng)膜病變，以及進行性的視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮導致視力嚴重下降及視功能障礙。本研究家系具有玻璃體濃縮、視網(wǎng)膜增生及牽拉、黃斑病變、視網(wǎng)膜脈絡膜萎縮等Wagner綜合征的較典型臨床表型，與國外對該病c.9265+1G>A這一變異位點的相關研究結(jié)果比較[25-26]，本研究中Wagner綜合征家系的眼前節(jié)相關癥狀及體征，如淺前房及伴發(fā)急性閉角型青光眼、早發(fā)白內(nèi)障及懸韌帶異常、晶狀體脫位等相關表型未見報道。本研究于國內(nèi)首次報道了中國漢族Wagner綜合征一家系的VCAN基因變異，為該疾病家系臨床表型及基因變異位點提供了更多的數(shù)據(jù)，對指導Wagner綜合征的診斷具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明蔡素萍：醞釀和設計試驗、實施研究、起草及修改文章；張達人、王婷婷：實施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章；羅小玲：修改文章；黃龍翔：分析和解釋數(shù)據(jù)、起草文章；許婷婷：采集數(shù)據(jù)、起草文章；劉旭陽：醞釀和設計試驗、指導試驗、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱及定稿