顧靜 易浩安 查旭 孔艷波 江偉陽 楊芳 李凡 何永蜀

1云南省殘疾人康復(fù)中心眼科，昆明 650032；2昆明醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，昆明 650500；3昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，昆明 650101；4昆明醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，昆明 650500

先天性虹膜缺損或無虹膜是一種罕見的常染色體顯性遺傳性眼組織畸形，其在中國的發(fā)病率約為1∶ 100 000[1]，以部分或全部虹膜缺損為主要臨床表現(xiàn)，同時可伴有其他眼部結(jié)構(gòu)異常，包括角膜混濁、青光眼、白內(nèi)障、晶狀體異位、斜視和眼球震顫等[2]。約2/3的虹膜缺損患者是由于家族遺傳引起，剩余的散發(fā)病例由新發(fā)生的基因突變引起[3]。先天性虹膜缺損發(fā)病無明顯的種族區(qū)別。人配對盒基因6(paired box gene，PAX6)是脊椎動物PAX基因家族成員之一，在神經(jīng)組織，尤其在眼的發(fā)育中起著重要作用[4]，至今人類基因組突變數(shù)據(jù)庫已收集592種PAX6基因突變(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=PAX6)，其中92%的突變與虹膜缺損或無虹膜有關(guān)。PAX6蛋白是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白通過與其配對的DNA結(jié)合域識別靶基因，從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]。PAX6基因突變占先天性虹膜缺損病因的90%以上，其變異方式多樣，有基因缺失、無義突變、移碼突變、剪切位點突變和錯義突變等[6]。除PAX6基因以外，其他與先天性虹膜缺損伴眼部疾病有關(guān)的基因包括ITPR1、ELP4、TRIM44、FOXE3、FOXC1和PITX2等[6-8]。本研究采用全外顯子測序和生物信息學(xué)分析方法對云南省先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障一家系進行致病基因分析，探討該家系發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究方法，2020年2月于云南省殘疾人康復(fù)中心和昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科收集云南漢族先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障一家系。該家系3代共8名成員，包括3例患者和5名表型正常者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批文號：審-PJ-2020-61)，所有參與研究的患者及家屬均對本研究目的知情并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1一般檢查 對先證者及其父母、子女和丈夫進行視力、驗光、角膜曲率檢查(ARK-1自動電腦驗光/角膜曲率儀，日本NIDEK公司)；采用裂隙燈顯微鏡(YZ5E，蘇州六六視覺科技有限公司)進行眼前節(jié)檢查；采用眼科A/B型超聲診斷儀(ODM_2100S，天津邁達醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)測量眼軸長度，并觀察玻璃體腔情況；采用眼科超聲生物顯微鏡(MD-300L，天津邁達醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)進行房角檢查及晶狀體厚度測量；采用非接觸式眼壓計(NT-2000，日本NIDEK公司)測量眼壓；采用光相干斷層掃描儀(Cirrus HD-OCT MODEL 500，德國Carl Zeiss公司)行視網(wǎng)膜層間結(jié)構(gòu)檢查；采用眼底照相機(TRC-NW7SF，日本Topcon公司)觀察視網(wǎng)膜情況。對該家系成員進行全身檢查，以排查是否伴有其他系統(tǒng)異常。

1.2.2基因檢測及數(shù)據(jù)分析 基因檢測和生物信息學(xué)分析由昆明醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系完成。采用高通量測序技術(shù)對先證者及其丈夫進行全外顯子組測序，外顯子區(qū)域使用Agilent SureSelect Human All Exon V6 kit(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)進行捕獲。DNA文庫采用NovaSeq6000高通量測序系統(tǒng)(Illumina,San Diego,CA,USA)進行雙端150 bp測序。原始測序數(shù)據(jù)使用FASTQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)進行質(zhì)量控制。利用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)[9]將reads比對到hg19人類基因組(UCSC human genome hg19 build)。單核苷酸變異和插入/缺失變異由SAMTOOLS[10]識別，并通過ANNOVAR[11]注釋，獲得變異位點的位置、變異類型、保守性、危害性等信息。并將變異位點比對到dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫(http://www.1000genomes.org)進行篩選。采用homozygositymapper[12]定位常染色體隱性遺傳可疑基因座。采用UGENE進行氨基酸保守性分析。采用Mutation Taster[13]預(yù)測變異對蛋白翻譯的影響。參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準與指南對變異位點進行致病性評估。針對篩選出的變異位點經(jīng)Sanger測序驗證，同時在家系成員中驗證共分離現(xiàn)象并確定變異位點。

2 結(jié)果

2.1 家系患者臨床表型

圖1 先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障患者家系圖 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；：先證者Figure 1 Pedigree of the family with congenital iris coloboma and congenital cataract □：normal male；○：normal female；■：male patient；●：female patient；：proband

該家系中第2代和第3代連續(xù)出現(xiàn)3例患者，其中男1例，女2例(圖1)。先證者Ⅱ-2，女，29歲，雙眼虹膜大部分缺損，僅周邊部見少量虹膜組織，晶狀體皮質(zhì)及后囊混濁，伴眼球震顫，眼部檢查無其他畸形，角膜透明，眼壓正常。先證者子女(Ⅲ-1、Ⅲ-2)均表現(xiàn)為先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障癥狀。先證者之子Ⅲ-1雙眼虹膜大部分缺損，僅可見周邊部分0.2～1.0 mm虹膜，雙眼晶狀體皮質(zhì)混濁累及后極部，并伴眼球震顫，角膜光滑透明，眼部檢查無其他畸形，眼壓正常。先證者之女Ⅲ-2雙眼虹膜大部缺損，僅可見周邊部分0.2～1.0 mm虹膜，雙眼晶狀體后囊輕度混濁，伴眼球震顫，角膜光滑透明，眼壓正常。該家系3例患者白內(nèi)障癥狀隨年齡增長進行性加重，未合并其他并發(fā)癥，患者臨床表現(xiàn)均支持先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障的診斷。先證者丈夫Ⅱ1雙眼眼位正，無眼球震顫。雙眼角膜、結(jié)膜正常，前房中深，鞏膜紋理清晰，瞳孔直徑2.5 mm，對光反射靈敏，晶狀體透明，眼底正常(圖2)。該家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳，為先證者新發(fā)變異并遺傳給下一代。

圖2 先證者Ⅱ-2及其兒子Ⅲ-1、丈夫Ⅱ-1右眼眼部檢查照片 A、C、E：Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅱ-1眼前節(jié)圖像 B、D、F：Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅱ-1眼底圖像Figure 2 Right eye images of proband Ⅱ-2,her son Ⅲ-1,and her husband Ⅱ-1 A,C,E：Anterior segment images of Ⅱ-2,Ⅲ-1 and Ⅱ-1 B,D,F：Fundus images of Ⅱ-2,Ⅲ-1 and Ⅱ-1

2.2 家系突變基因檢測分析

先證者及其丈夫的外顯子區(qū)域平均測序深度分別為145.56X和138.28X，平均測序深度>20X的百分比分別為99.0%和98.6%。按常染色體隱性遺傳方式分析，根據(jù)先證者及其丈夫的變異位點進行homozygositymapper定位分析，一共有32個常染色體隱性遺傳可疑基因座被鑒定，將其與先證者的基因組變異信息比較，一共篩選出7個可疑基因，分別為ZNF852、MICA、SLC37A4、VPS11、PTGES3、C14orf180和SPPL2B，但未發(fā)現(xiàn)這些基因與眼發(fā)育相關(guān)的證據(jù)和資料，不能支持該病的常染色體隱性遺傳方式。按常染色體顯性遺傳方式進行分析，在先證者PAX6基因第8外顯子上發(fā)現(xiàn)了1個雜合單堿基插入導(dǎo)致的移碼突變c.415dupA(p.R139fs)，OMIM數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫和ClinVar數(shù)據(jù)庫均未報道該變異。先證者丈夫不存在該變異。MutationTaster預(yù)測結(jié)果顯示，該變異位點位于PAX6蛋白高度保守區(qū)，屬于移碼突變，影響了后續(xù)蛋白質(zhì)的正常翻譯。結(jié)合本家系特征，認為該家系符合常染色體顯性遺傳。Sanger測序結(jié)果顯示，家系中3例患者(先證者及其子女)均攜帶此移碼突變，均為雜合變異，先證者父母及其丈夫不攜帶此變異，符合家系共分離(圖3)。PAX6同源蛋白序列比對結(jié)果顯示，發(fā)生移碼突變的位點在各物種間保守(圖4)。進一步分析其改變后對氨基酸序列的影響，發(fā)現(xiàn)移碼突變后僅翻譯7個氨基酸就出現(xiàn)了終止密碼，此變異對PAX6蛋白一級結(jié)構(gòu)改變巨大(圖5)。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準與指南，移碼突變評為PVS1，數(shù)據(jù)庫正常人群對照中未發(fā)現(xiàn)該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，該變異總致病性評分為PVS1+PM2+PP1，為致病性變異。

圖3 PAX6基因c.415dupA變異Sanger測序圖 箭頭所示為插入位點Figure 3 Sanger sequencing map of PAX6 c.415dupA variant Arrow showed the insertion site

圖4 PAX6同源蛋白序列比對圖 PAX6蛋白第139位精氨酸在物種間高度保守Figure 4 Sequence alignment of PAX6 homologous proteins The arginine at position 139 of PAX6 protein was highly conserved among multiple species

圖5 c.415dupA(p.R139fs)對PAX6翻譯的影響 野生型翻譯出完整的PAX6序列，c.415dupA(p.R139fs)在插入位點后翻譯7個氨基酸停止翻譯Figure 5 Effect of c.415dupA (p.R139fs) on PAX6 translation The wild type normally translated the complete sequence of PAX6,but translation stopped with 7 amino acids translated after the insertion of c.415dupA (p.R139fs)

3 討論

先天性虹膜缺損是在胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)外胚層和中胚層發(fā)育障礙導(dǎo)致的眼部結(jié)構(gòu)發(fā)育異常[2]。PAX6基因在眼的正常發(fā)育中起著極其重要的作用，其位于11號染色體短臂1區(qū)3帶(11p13)，全長22 kb，含14個外顯子，第1～3外顯子屬于非編碼區(qū)，第4～14外顯子編碼含436個氨基酸的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，通過識別特定的堿基序列與之結(jié)合調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。PAX6基因是同源異形基因，其功能特點與基因劑量有關(guān)，同源染色體上PAX6等位基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是眼正常發(fā)育的關(guān)鍵；如果其中1個PAX6等位基因由于染色體重排發(fā)生缺失或基因突變不能行使其功能，將導(dǎo)致PAX6基因單倍體劑量不足，80%～90%的虹膜缺損或無虹膜與PAX6基因單倍體劑量不足有關(guān)[16]。由于PAX6基因的劑量敏感性，單倍體劑量不足將影響人正常視杯視柄的發(fā)育，改變虹膜和睫狀體組織的生長和分化，出現(xiàn)無虹膜或虹膜缺損癥狀[17]。

本家系中先證者父母未患病，因此我們首先判斷家系遺傳方式為常染色體隱性遺傳，但進行生物信息學(xué)分析后不支持該家系為常染色體隱性遺傳。隨后，我們發(fā)現(xiàn)先證者PAX6基因第8外顯子上存在1個對蛋白結(jié)構(gòu)和功能可能有顯著影響的移碼突變c.415dupA(p.R139fs)，該變異位點尚未見報道。PAX6基因是先天性虹膜缺損的致病基因，多為常染色體顯性遺傳，該家系符合家系共分離，雜合子患病和系譜連續(xù)傳遞方式證實此病的常染色體顯性遺傳方式。此外，先證者父母未攜帶該變異，也無任何先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障的臨床表型，提示這一變異是由于先證者父母在減數(shù)分裂中發(fā)生錯誤等原因?qū)е略摬〉陌l(fā)生，為新發(fā)變異，詳細機制有待進一步研究。我們通過外顯子測序同樣檢測了與先天性無虹膜有關(guān)的ITPR1、ELP4、TRIM44、FOXE3、FOXC1和PITX2基因外顯子部分的變異，但未發(fā)現(xiàn)可能影響蛋白功能的變異，排除了已報道該病的其他致病基因可能。因此，可以認定該變異位點是導(dǎo)致該家系虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障的原因。此外，本研究中使用基于序列建模的網(wǎng)站swiss-model以及phyre2進行了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建，但因PAX6蛋白僅有36%的同源序列，且均位于N端，后面的序列無法基于同源建模預(yù)測?；谀壳暗哪Ｐ徒Y(jié)果，無法預(yù)測該變異影響的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。其他PAX6基因變異導(dǎo)致的先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障家系多表現(xiàn)為完全無虹膜合并白內(nèi)障[18-21]，而該家系患者均存在部分虹膜并伴有眼球震顫。既往PAX6基因移碼突變家系多報道為完全無虹膜[22]，本研究發(fā)現(xiàn)的c.415dupA移碼突變還可見周邊部分0.2～1.0 mm虹膜。該病患者由于發(fā)病年齡小，治療難度大，生活質(zhì)量受到較大影響。高通量測序技術(shù)在檢測罕見遺傳病方面發(fā)揮著越來越重要的作用，通過高通量測序技術(shù)鑒定這些家系中的致病基因及位點能夠盡早發(fā)現(xiàn)病因，提高優(yōu)生質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)PAX6基因第8外顯子1個新發(fā)雜合移碼突變c.415dupA(p.R139fs)導(dǎo)致先天性虹膜缺損合并先天性白內(nèi)障，生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示該變異位點位于蛋白質(zhì)高度保守區(qū)，導(dǎo)致mRNA編碼錯位，使蛋白后續(xù)翻譯錯誤，產(chǎn)生異常蛋白而喪失功能。該變異的發(fā)現(xiàn)為PAX6基因在虹膜發(fā)育中起著不可或缺的作用提供了更多的證據(jù)，同時豐富了人類PAX6基因變異譜，為產(chǎn)前診斷和優(yōu)生優(yōu)育提供了重要依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明顧靜、孔艷波：實施研究、收集與分析臨床資料、文章撰寫；易浩安、江偉陽、楊芳：實施研究、文章撰寫；查旭：實施研究、收集與分析臨床資料；李凡、何永蜀：參與選題和設(shè)計試驗、修改文章及定稿