古家潤(rùn)，彭國(guó)璇，張安強(qiáng)，鄧 進(jìn)，夏 飛

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診外科，貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004;3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042

膿毒癥是一種由病原體侵襲機(jī)體導(dǎo)致免疫功能紊亂的綜合征，常常伴有炎癥相關(guān)性損傷和多器官功能障礙等嚴(yán)重臨床表現(xiàn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，全球每年有超過1 800萬(wàn)嚴(yán)重膿毒癥病例，病死率高達(dá)30%～70%，膿毒癥已逐漸成為重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)非心臟病患者死亡的主要原因。中性粒細(xì)胞是人類含量最豐富的白細(xì)胞，可激活膿毒癥發(fā)生過程中固有免疫調(diào)節(jié)[3]。大量研究證明[4-5]，中性粒細(xì)胞的趨化、吞噬和殺菌作用參與了膿毒癥多器官功能衰竭進(jìn)程，具體作用機(jī)制復(fù)雜。在膿毒癥發(fā)生時(shí)，病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associatedmolecularpattern，DAMP)可以激活中性粒細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，活化的中性粒細(xì)胞釋放游離DNA(cell free DNA,cfDNA)并鑲嵌瓜氨酸化組蛋白(citrullinated histone3，Cit-H3)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)等共同組成的網(wǎng)狀物質(zhì)，即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)[5]。NETs可以捕獲并殺滅病原微生物，發(fā)揮炎癥防御反應(yīng)[6]。然而，NETs中包含的DNA和蛋白質(zhì)對(duì)免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的過度刺激作用，隨著NETs的廣泛形成可能會(huì)導(dǎo)致炎癥和組織損傷的持久存在，并且過量的NETs會(huì)損害微循環(huán)，參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)膿毒癥微血栓形成，導(dǎo)致多器官功能衰竭[7]。因此，NETs的雙向調(diào)節(jié)既能促使病原體的清除，但功能亢進(jìn)時(shí)也能造成組織損傷并導(dǎo)致多器官功能衰竭[8]。本綜述擬總結(jié)中性粒細(xì)胞NETs在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，以期為膿毒癥治療提供理論依據(jù)。

1 NETs的形成及炎癥調(diào)節(jié)作用

NETs形成過程被稱為“NETosis”，最初被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞不同于細(xì)胞壞死和凋亡的一種特殊的細(xì)胞死亡形式，被稱為自殺性中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成(“suicidal NETosis”)，2004年被Brinkmann等[5,9]首次發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物、佛波脂(phorbol myristate acetate,PMA)等化學(xué)物質(zhì)以及干擾素、白介素8等細(xì)胞因子可激活NETosis，活化的中性粒細(xì)胞通過PKC/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑增加NADPH氧化酶以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并增加鈣離子流入，激活肽基精氨酸脫氨酶4(peptidyl arginine deaminase 4，PAD4)，進(jìn)而誘導(dǎo)組蛋白精氨酸殘基瓜氨酸化，導(dǎo)致核DNA解聚以及核膜破裂，釋放解聚核DNA，結(jié)合胞質(zhì)蛋白，包括NE、MPO、Cit-H3等抗菌蛋白，最后破壞質(zhì)膜，釋放到胞外環(huán)境中形成NETs，此過程發(fā)生時(shí)，NE和MPO遷移到細(xì)胞核，促進(jìn)組蛋白的裂解，參與核DNA解聚[10-12]。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞釋放NETs后仍存在保持細(xì)胞活性及功能的形式，稱為非裂解性中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成(“vital NETosis”)。“vital NETosis”相較于“suicidal NETosis”更加迅速，僅持續(xù)30min左右，而“suicidal NETosis”通常需要3h左右[13]。“vital NETosis”包括核DNA和線粒體DNA兩種形式。中性粒細(xì)胞受到刺激后，核DNA NETosis依賴血小板-中性粒細(xì)胞相互作用。中性粒細(xì)胞通過與血小板Toll樣受體 4(toll-like receptors 4,TLR 4)、Toll樣受體 2(toll-like receptors 2,TLR2)相互作用，核膜形態(tài)發(fā)生變化，以允許囊泡萌發(fā)，這些含有核DNA的小泡穿過細(xì)胞質(zhì)與質(zhì)膜結(jié)合，并在細(xì)胞外釋放，形成NETs[14]。NETs釋放后，這些中性粒細(xì)胞仍然能夠保持趨化性和吞噬細(xì)菌等功能。線粒體DNA NETosis需要粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或補(bǔ)體因子5a(complement factor 5a，C5a)參與，該過程以ROS依賴性的方式產(chǎn)生，并且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，其具體過程尚不清楚[15]。見圖1。

2 NETs的抗菌作用

NETs特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及鑲嵌的抗菌蛋白使得NETs具有捕獲和殺滅包括細(xì)菌、病毒和真菌等病原微生物的作用。Buchanan 等[16]使用表達(dá)脫氧核糖核酸酶 (deoxyribonuclease，DNase) 的A 組鏈球菌處理壞死性筋膜炎小鼠模型，他們發(fā)現(xiàn)用表達(dá) DNase 的菌株處理的小鼠皮膚損傷更嚴(yán)重、細(xì)菌感染范圍更大，這表明NETs可以殺滅細(xì)菌并限制感染擴(kuò)散。 Jenne等[17]通過靜脈注射痘病毒處理小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟中NETs形成增加并保護(hù)宿主細(xì)胞免受痘病毒侵害，他們強(qiáng)調(diào)了NETs在預(yù)防病毒感染方面的作用。Silva等[18]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞響應(yīng)煙曲霉釋放NETs并抑制其孢子萌發(fā)，表明NETs讓宿主在煙曲霉菌等真菌感染中受益。然而，一些病原微生物進(jìn)化出了逃逸機(jī)制以抵抗NETs的捕獲。例如，Paracoccidioides brasiliensis釋放一種 DNase 樣蛋白，可破壞DNA結(jié)構(gòu)，從而抵抗NETs捕獲，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[19]。

3 NETs介導(dǎo)膿毒癥器官功能障礙

3.1膿毒癥中NETs介導(dǎo)組織損傷 在膿毒癥發(fā)生時(shí)，NETs可以捕獲并殺滅病原微生物。然而，NETs中包含的DNA和蛋白質(zhì)對(duì)免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的過度刺激作用，隨著NETs的廣泛形成可能會(huì)導(dǎo)致炎癥和組織損傷的持久存在。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者循環(huán)中過量的NETs成分，包括cfDNA和組蛋白，與多器官功能衰竭密切相關(guān)[20]。在膿毒癥小鼠模型中，利用外源性DNase增加cfDNA的清除率，可有效改善膿毒癥小鼠器官損傷并提高生存率[21]。同時(shí)，研究表明cfDNA可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子表達(dá)升高，參與膿毒癥免疫反應(yīng)[22]。這些數(shù)據(jù)表明，cfDNA與膿毒癥炎癥反應(yīng)和組織損傷密切相關(guān)，但確切機(jī)制尚不清楚。

NETs釋放組蛋白占所含蛋白的70%左右[23]。組蛋白作為強(qiáng)力抗菌因子的同時(shí)，亦作為趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞死亡、促進(jìn)炎癥因子釋放，并具有直接細(xì)胞毒性作用來(lái)誘導(dǎo)組織損傷[7]。給予小鼠外源性組蛋白，可導(dǎo)致白介素6和 TNF-α等炎癥因子表達(dá)增加，并損傷組織細(xì)胞[24]。人類內(nèi)皮細(xì)胞體外研究發(fā)現(xiàn)，胞外組蛋白具有直接細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)ROS來(lái)調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生，從而直接導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[25]。以上結(jié)果說(shuō)明，NETs的過度激活會(huì)導(dǎo)致組織損傷，與膿毒癥器官功能障礙密切相關(guān)。

3.2膿毒癥中NETs介導(dǎo)凝血功能障礙 凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)通常處于動(dòng)態(tài)平衡，但膿毒癥期間全身炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致凝血系統(tǒng)異常激活形成血栓，使血小板減少、凝血因子耗竭，最終可發(fā)展為彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC),并導(dǎo)致多器官功能衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥期間中性粒細(xì)胞NETs與血栓形成密切相關(guān)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血小板-中性粒細(xì)胞相互作用。

血管內(nèi)皮受損在膿毒癥血栓形成中起重要作用。膿毒癥期間，中性粒細(xì)胞被募集到感染和損傷部位并釋放NETs。NETs通過白介素1α 和組織蛋白酶G的協(xié)同作用促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活并增加血栓形成[26]。同時(shí)，NETs以劑量依賴的方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，并通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[27-28]?？傊?，NETs參與并放大了與膿毒癥血栓形成相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

血小板是免疫血栓形成的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。膿毒癥期間，血小板和中性粒細(xì)胞相互作用促進(jìn)NETs參與先天性免疫反應(yīng)[29]。通過LPS處理的小鼠中性粒細(xì)胞釋放大量NETs，然而相同劑量的LPS條件下，血小板耗竭的小鼠則不會(huì)發(fā)生這個(gè)過程，表明膿毒癥中NETs的釋放高度依賴血小板-中性粒細(xì)胞的相互作用[30]。血小板通過P-選擇素與中性粒細(xì)胞受體P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoproteinlig-1， PSGL-1)相互作用誘導(dǎo)膿毒癥NETs[31]。被激活的血小板釋放多種細(xì)胞因子，包括高遷移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)、血小板因子4(platelet factor 4，PF4)、趨化因子CXCL4和趨化因子(CCL)，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞NETs。HMGB1是一種DAMP，通過與晚期糖基化終產(chǎn)物(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)受體結(jié)合，激活中性粒細(xì)胞NETs[32]。血小板衍生因子PF4、CXCL4和CCL5可通過中性粒細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NET[33]。LPS也可以通過TLR4或TLR2受體激活血小板-中性粒細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)NETs[34]。同時(shí)，中性粒細(xì)胞NETs可以促進(jìn)血小板黏附、活化、聚集，并為血栓形成提供支架，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致血小板的過度耗竭和小血管閉塞，最終可發(fā)展為DIC[35]。

3.3NETs作為膿毒癥潛在的治療靶點(diǎn) 盡管NETs表現(xiàn)出一定的抗菌效應(yīng)，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)NETs的過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失調(diào)和凝血功能障礙，與膿毒癥多器官功能衰竭密切相關(guān)。因此，以NETs作為新的治療靶點(diǎn)有望成為膿毒癥免疫治療的新策略。

通過中和NETs成分，增加NETs清除。研究發(fā)現(xiàn)，使用DNase治療膿毒癥小鼠，可減少循環(huán)中cfDNA的含量，增加NETs的清除，有效減輕多器官功能障礙并提高小鼠生存率[19,34]。NETs的主要成分之一Cit-H3作為一種DAMP，有直接細(xì)胞毒性、促炎和促進(jìn)血栓形成的特點(diǎn)，因此可作為膿毒癥潛在的分子靶標(biāo)。研究證實(shí)，中和膿毒癥小鼠循環(huán)中Cit-H3，可有效減輕膿毒癥小鼠肺損傷并提高生存率[36]。

減少NETs形成。鑒于PAD4在膿毒癥介導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs中的重要作用，靶向PAD4似乎是減少中性粒細(xì)胞NETs的有效途徑。通過PAD4基因缺陷小鼠膿毒癥模型發(fā)現(xiàn)，PAD4缺乏可減輕NETs介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷和器官功能障礙[37]。但抑制PAD4基因表達(dá)的長(zhǎng)期病理生理表現(xiàn)尚不清楚，因此以PAD4作為治療靶點(diǎn)開發(fā)藥物仍存在巨大挑戰(zhàn)。

4 總結(jié)與展望

膿毒癥目前仍是危重癥領(lǐng)域的治療難點(diǎn)，其發(fā)生發(fā)展復(fù)雜，常合并多器官功能障礙，導(dǎo)致其病死率居高不下。中性粒細(xì)胞NETs在其中發(fā)揮“雙刃劍”作用。在膿毒癥早期，中性粒細(xì)胞NETs捕獲和殺滅病原體的能力可有效限制感染擴(kuò)散，減緩膿毒癥的進(jìn)程。但隨著中性粒細(xì)胞NETs的廣泛形成會(huì)造成組織損傷以及凝血功能障礙，與膿毒癥多器官功能衰竭密切相關(guān)。因此，中性粒細(xì)胞NETs的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)限制膿毒癥的進(jìn)展似乎有重要作用。在不損害中性粒細(xì)胞NETs抗菌功能的前提下，減少NETs的過度生成或加速NETs的清除，維持NETs的動(dòng)態(tài)平衡有望成為膿毒癥治療的新策略。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：古家潤(rùn)：文章選題、撰寫；彭國(guó)璇、張安強(qiáng)、

鄧進(jìn)：文獻(xiàn)查閱;夏飛：文章選題