李 娟，郝婷婷，張慧瑩，劉 剛，米耀云，李河林，敬曉棋*

(1.榆林學院生命科學學院/榆林市動物疾病診斷與防治重點實驗室，陜西榆林 719000；2.清澗縣農業(yè)綜合執(zhí)法大隊，陜西榆林 718399；3.榆林市榆陽區(qū)動物疫病預防控制中心，陜西榆林 719000)

呼吸系統(tǒng)疾病對動物健康和畜牧經濟效益影響巨大，呼吸道微生物與呼吸道疾病的相關性也逐漸被發(fā)現，動物呼吸系統(tǒng)微生物功能機制的研究，已成為對畜禽生產具有重大科學和經濟價值的課題。準確了解呼吸系統(tǒng)微生物多樣性，對該類疾病的有效預防、合理用藥意義重大。常規(guī)的實驗室培養(yǎng)有很大的局限性，無法完全模擬機體環(huán)境，只能對1%～3%的微生物進行培養(yǎng)，不能獲取樣本中的全部微生物，且培養(yǎng)時間較長、靈敏度較低、特異性差，難以實現對有機體內復雜微生物群落的研究。隨著分子生物學技術和高通量測序技術的快速發(fā)展，16S rRNA基因測序技術在動物呼吸系統(tǒng)微生物多樣性研究中應用越來越多。文中將對16S rRNA擴增子測序技術的概況以及其研究動物呼吸道微生物多樣性在不同部位的差異、外界因素對呼吸道微生物多樣性的影響方面的應用進行綜述。

1 16S rRNA基因擴增子測序概述

在細菌總RNA中16S rRNA占80%以上，16S rRNA基因序列中含9個可變區(qū)及10個保守區(qū)，保守區(qū)是細菌共有部分，反映物種間的親緣關系；而可變區(qū)體現了物種間的差異，差異越大，親緣關系越遠。16S rRNA擴增子測序技術是選擇16S rRNA上的可變區(qū)，用通用引物擴增樣品DNA、高通量測序，再將測序結果與已知16S rRNA數據庫進行比對，分析獲得樣本物種分類及豐度、菌群結構、系統(tǒng)進化等諸多信息。

16S rRNA擴增子測序技術經歷了一代測序、二代測序、三代測序三個階段。一代測序技術主要指1977年Sanger F等[1]提出的DNA雙脫氧鏈終止法和Maxam A M等[2]提出的DNA化學降解測序法。Sanger法(用2,3-雙脫氧核苷三磷酸作底物，測定DNA中核苷酸序列)的優(yōu)勢是讀長可達1 000 bp，準確性可達99.999%，因測試速度慢、成本高、通量低等不足，沒有被大范圍的應用。經過不斷的優(yōu)化和改進，在2005年-2008年間，陸續(xù)產生了454測序系統(tǒng)、Solexa測序技術以及SOLiD測序技術等二代測序技術，二代測序技術具有通量高、覆蓋率高、速度快的優(yōu)勢，但卻存在讀長短的缺陷，不利于生物信息學分析，且易受GC含量和重復讀長的影響。2008年之后出現的He-licos單分子測序儀、SMRT技術和納米孔單分子測序技術等三代測序技術讀長長、運行快、不受GC堿基偏好影響、直接檢測表觀修飾位點等優(yōu)點,無PCR擴增環(huán)節(jié)，避免PCR擴增引入錯誤，在微生物的分類鑒定和群落多樣性的研究中更具有優(yōu)勢。目前，PacBio等三代測序平臺對16S rRNA可進行全長測序，序列比對率和鑒定準確率都高于二代測序[3]。

16S rRNA擴增子測序技術最初在無機環(huán)境如水、土壤、食品微生物群組研究中應用，現已廣泛用于畜禽、水生動物、野生動物及人等機體腸道微生物菌群結構和組成的檢測，近年也開始在呼吸道微生物研究中應用。

2 在動物呼吸系統(tǒng)微生物多樣性研究中的應用

16S rRNA擴增子測序技術促進了對呼吸道存在的難以培養(yǎng)、低生物量微生物群落的研究，豐富了人們對呼吸道內環(huán)境的認識。之前一直認為氣管、支氣管、肺臟等下呼吸道是無菌的，2010年，Hilty等對肺部進行16S rRNA測序發(fā)現了肺臟部位微生物的存在[4]。呼吸道復雜的微生物群組，在維持呼吸道健康、誘導呼吸道疾病的發(fā)生中起著重要的作用。通過對呼吸系統(tǒng)微生物多樣性的研究，探索其作用的具體機理是最近階段的熱門課題。

2.1 健康動物呼吸道中的微生物多樣性在不同空間位點有差異性

呼吸系統(tǒng)各部位的生理結構和理化特征不同，微生物組成也有差異。研究發(fā)現，某些致病菌在健康動物上呼吸道的能夠正常共生，卻也能在全球范圍內引起地方性肺炎[5]。因此，了解上、下呼吸道微生物組之間復雜的相互作用，已成為一個對動物健康和養(yǎng)殖回報具有重大科學興趣的話題。Pirolo M等[6]詳細綜述了豬上呼吸道和下呼吸道的微生物群落結構，發(fā)現上呼吸道的主要為變形菌門和厚壁菌門，與下呼吸道的相對豐度方面存在差異；鼻咽腔和口咽腔微生物在屬水平上有顯著差異。何川川[7]研究健康與患病綿羊鼻腔、氣管上端、氣管下端、肺臟幾個部位微生物的分布狀況，發(fā)現健康綿羊呼吸系統(tǒng)4個部位的細菌和真菌在門、屬水平上有差異，從鼻腔部位至肺臟微生物物種的豐富度有所降低，但均勻度有所增加。健康綿羊呼吸道內部幾乎都有真菌群的存在，但在病羊呼吸道的幾個部位中并未檢測出真菌。Mcmullen C等[8]詳細研究健康牛整個呼吸道17個部位存在的細菌微生物不同部位微生物群落的豐富度和多樣性。這些差異是由各種類群驅動的，特別是支原體、鏈球菌和梭桿菌；肺微生物群與鼻咽部更相似。上呼吸道微生物群落豐富度比下呼吸道高，可能是因為上呼吸道所處環(huán)境細菌負荷更高[9]，微生物種類更為豐富。

2.2 健康動物呼吸道中的微生物多樣性在不同時間點有差異性

健康動物呼吸道微生物在不同時間也會有所變化。呼吸道微生物在母體分娩過程中、出生后就開始定植，后期因生長活動和外界因素的變化而變化。母豬的陰道和乳頭皮膚微生物群是仔豬出生前8 h上呼吸道的重要來源[10]，出生后前7周內鼻腔微生物群的組成和結構發(fā)生了顯著變化，斷奶后2周～3周后趨于穩(wěn)定[11]。牛鼻咽部細菌的豐度(16S rRNA基因拷貝數)從出生到14 d顯著增加，然后略有下降到35 d[12]或保持到 42 d[13]。斷奶前犢牛鼻咽微生物群以變形菌門為主，第14天后，顯示其微生物的多樣性(結合豐富度和均勻度)增加，最豐富的細菌屬為曼氏菌、莫拉氏菌、支原體、嗜冷桿菌和假單胞菌。同時這些屬的細菌的相對豐度隨時間的推移而變化，莫拉氏菌的相對豐度在第14天至第35天之間下降，曼海氏菌和支原體的相對豐度同時大幅增加[12]。Ngunjiri J M等[14]對健康蛋雞在1、3、5、8、12、16、25、36、51周齡時，呼吸道微生物進行研究，發(fā)現年齡對呼吸道微生物細菌β多樣性有巨大影響。隨著雞的年齡增長，氣管微生物群落組成發(fā)生著非常緩慢的變化，在育雛(0周～5周)、生長(6周～16周)和產蛋(17周以后)階段之間沒有明顯的差異。鼻微生物群落在育雛和成長階段逐漸轉變，在過渡到產蛋階段(16周～25周)后變化更為劇烈。

2.3 動物呼吸道微生物多樣性受外界因素的影響

呼吸道微生物群落與宿主處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持呼吸道健康。當外界環(huán)境改變超過微生物系統(tǒng)調節(jié)范圍時，這種平衡被破壞，條件致病微生物開始發(fā)揮作用，表現出咳嗽、流鼻涕、呼吸困難等臨床癥狀。

2.3.1 環(huán)境因素影響 呼吸道傳染病的發(fā)生往往與周圍環(huán)境密切相關。環(huán)境因子的改變引起宿主免疫力降低，易感性增加，誘發(fā)傳染病。運用16S rRNA擴增測序技術發(fā)現，氣態(tài)氨濃度、輸送、農場管理等環(huán)境因素對呼吸道傳染病也有影響。

氨氣是養(yǎng)殖場主要污染氣體之一，氣態(tài)氨對動物和人類健康有害，濃度高的氣態(tài)氨對呼吸道刺激強烈，能夠抑制呼吸系統(tǒng)的效率。Wang T X等[15]研究了低濃度氣態(tài)氨暴露期間豬鼻腔微生物群落的動態(tài)變化，氨水平升高，會顯著損害氣管黏膜和肺泡，并降低生長性能；高出一定值會減少乳酸桿菌等有益細菌的定植，增加莫拉氏菌和鏈球菌的數量。

運輸使動物暴露于各種潛在壓力之下，帶來嚴重的影響。運輸引發(fā)的呼吸道疾病，與特定病原體無關，與不同細菌種類的組合有關[16]。之前有研究顯示，肉牛[17]和馬[18]經過長途運輸轉移到新環(huán)境時，鼻咽微生物群的多樣性發(fā)生顯著變化。Zhao F W等[19]通過16S rRNA測序技術，發(fā)現健康驢子經過長途運輸后，驢鼻腔微生物群中變形菌門和擬桿菌門的細菌數量增加，厚壁菌門的細菌數量減少，改變了鼻微生物群的豐富性和多樣性。

Weese等[20]報道了不同飼喂方式導致豬鼻腔微生物群中巨球菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬和纖維桿菌屬等的相對豐度出現顯著差異。Nicola等使用IlluminaMiSeq測序平臺對來自6個不同農場犢牛呼吸道的微生物群落組成進行了表征和比較，發(fā)現不同農場的牛呼吸道微生物群落組成不同。

2.3.2 抗生素影響 在養(yǎng)殖業(yè)中抗生素是動物治療和保健中最常用也是最經濟有效的手段。但抗生素的使用與病原菌耐藥基因的傳播和增多密切相關。已有研究表明，抗生素的活性譜、給藥途徑、藥代動力學和藥效學特性不同，對微生物群組成的影響不同；給藥途徑、持續(xù)時間和劑量也會對微生物群組產生不同的影響[21]?？股貙粑啦煌课坏挠绊戇^程以及潛在的機制仍然是一個主要的研究目標。

Kathy T M等[22]首次發(fā)現斷奶后仔豬在接受土霉素的飼料添加與肌肉注射兩種給藥方式時，鼻腔細菌多樣性都會下降，對扁桃體微生物群的影響不大。與注射法相比，飼料中添加土霉素對鼻腔微生物群的影響更大，可能與豬采食時鼻腔和飼料中的土霉素接觸更多有關。Bond等[23]使用高通量測序研究地塞米松對健康馬和輕度哮喘馬的上、下呼吸道細菌群落的影響，發(fā)現地塞米松對健康馬和輕度哮喘馬的上呼吸道微生物群的作用效果不明顯，但對健康馬和輕度哮喘馬的下呼吸道微生物群都有影響。地塞米松給藥10 d后，健康馬和輕度哮喘馬的下呼吸道都經歷了11個OTU豐度的顯著變化，鏈球菌屬等OTU豐度增加，而CandidatusSaccaribacteriaOTU豐度減少，也沒有檢測到下呼吸道炎癥對地塞米松的免疫抑制作用的影響造成的差異。Mohamed Z等[24]研究結晶性頭孢噻呋游離酸(CCFA)、硫拉霉素(TUL)、氧環(huán)素(OTC)和普卡因西林G(PPG，PPG)5種不同抗生素胃腸外常規(guī)劑量給藥后，健康生長的豬鼻腔微生物群落組成和多樣性在第1、3、7、14天的變化。結果顯示，抗生素腸外單劑量給藥對豬鼻腔微生物群會產生影響，而這種影響是可變的。在不同的抗菌組之間，不同采樣日細菌屬相對豐度變化的時間模式不同。這一發(fā)現將有助于制定抗生素的替代策略，以改善豬的健康和生產。

2.4 腸道微生物的影響

研究發(fā)現，腸道微生物群可通過與肺部微生物群之間的串擾影響肺部健康，這被稱為“腸-肺軸”[25],“腸-肺軸”是雙向的，即腸道微生物群通過腸道免疫細胞識別共生體和病原體后，釋放的微生物產物和免疫調節(jié)劑，可以調節(jié)肺免疫，影響肺微生物群，反之亦然。微生物群產生的短鏈脂肪酸、代謝物或細菌素，可能會直接與病毒顆粒相互作用，改變侵染力或治療效果[26]。在醫(yī)學上，對新冠肺炎患者的上呼吸道和腸道微生物進行16S rRNA測序，結果顯示從感染初期的生態(tài)失調到后來多樣化的整個過程都在同步變化。這一發(fā)現在當時沒有針對COVID-19的特定抗病毒藥物和疫苗的情況下，對新型冠狀病毒防控具有臨床意義[27]。腸道和呼吸道微生物群的精確干預和調節(jié)可能提供新的治療選擇，益生菌(如雙歧桿菌和糞桿菌)、益生元(如低聚木糖)治療或共生治療可用于調節(jié)腸道和呼吸道微生物群，以促進COVID-19患者的康復[28]。在動物方面，Meera等應用16S rRNA測序技術研究腸道微生物組成對豬肺炎支原體易感性的影響，分析3周齡(斷奶)、8周齡(接種豬肺炎支原體之前)和12周齡(接種豬肺炎支原體之后)時，豬腸道中細菌群落的差異和豐度，認為仔豬腸道微生物組的多樣性和組成與豬肺炎支原體接種后的發(fā)展有潛在關聯(lián)[29]。腸道微生物群的缺乏增加了雞感染馬立克氏病病毒的嚴重程度，同時在感染后4 d，腸道菌群衰竭，雞法氏囊中IFN-α、IFN-β和IFN-γ的轉錄增加[30]。

3 小結與展望

上面介紹了16S rRNA基因測序的基本概況，歸納了用16S rRNA測序技術評估時空、環(huán)境、抗生素、腸道微生物對動物呼吸道微生物多樣性的影響。表明不同時空位點、環(huán)境條件、抗生素作用及腸道微生物，都會影響動物呼吸道微生物群落的多樣性。

16S rRNA測序技術極大的推動了人類探索和研究動物呼吸道微生物多樣性的進程，但仍有一些不可回避的局限性，如對樣本中物種組成只能分辨到屬水平的相對豐度；且結果受樣本起始濃度、PCR循環(huán)數、擴增引物等諸多因素影響；基于DNA的微生物分析目前無法區(qū)分DNA、活細菌和被肺免疫機制殺死的細菌，導致對細菌豐度和多樣性的高估等問題。隨著分子生物技術的發(fā)展、測序平臺的改進、信息技術的提升，16S rRNA測序技術將得到不斷完善，應用前景更加廣闊。在動物呼吸道微生物多樣性研究中，16S rRNA區(qū)域的選擇、測序平臺和用于分析的生物信息學工具存在顯著差異[6]。試劑盒[31]、采樣部位和采樣方法也是造成不同實驗室結果差異的因素。因此，我們認為，今后關于宏基因組分、試劑盒選擇、采樣或將趨于標準化，更有利于研究。

人們對動物呼吸道微生物群落的認識還比較有限，相關研究多見于多樣性的分析和病原菌的篩選方面，微生物群落與動物呼吸系統(tǒng)疾病之間復雜的相互關系和作用機制，將是今后研究的重點和難點。

研究范圍全面系統(tǒng)化。隨著微生物組研究的不斷發(fā)展，越來越明顯的是，動物的健康和生產性能在一定程度上受棲息在體內不同的非致病共生體的影響。今后，呼吸道微生物多樣性的研究位點的選擇將趨于整個系統(tǒng) 、時間選擇也將會趨于對整個生命周期、比較的層面也更加全面，從動物整體免疫機能角度研究呼吸道疾病的防治。