白新棟，王 斌，王晨驍，王小園，王 娟，劉海金，楊增岐，黨如意

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)屬于弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于水體及土壤中，絕大多數(shù)菌株是動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群，而一些致病性菌株，是水生生物尤其是魚(yú)類的重要致病菌[1-2]，亦可引起其他多種動(dòng)物和人的感染，導(dǎo)致胃腸炎甚至敗血癥等[3-4]。近年來(lái)，關(guān)于維氏氣單胞菌的病例報(bào)道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢(shì)且危害越來(lái)越嚴(yán)重[5-6]。

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii) 屬于腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，革蘭氏染色陰性，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，并且也普遍存在于自然界中，是一種典型的人-獸-水生生物共患病條件性致病菌[7-8]。近年來(lái)有關(guān)弗氏檸檬酸桿菌感染多種水生生物、哺乳動(dòng)物和人的病例報(bào)道越來(lái)越多，表明該菌對(duì)動(dòng)物和人類的危害有加重的趨勢(shì)[9]。

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，為革蘭氏陰性直桿菌，廣泛分布于自然界中，絕大多數(shù)于正常條件下是人和動(dòng)物腸道內(nèi)共棲菌，一定條件下可致病，少數(shù)具有致病性，通常將此類大腸埃希氏菌稱為致病性大腸埃希氏菌，可引起許多動(dòng)物和人的多種病型的大腸桿菌病[10]。

2021年5月，購(gòu)自陜西藍(lán)田縣某養(yǎng)殖基地的4只觀賞用天鵝，于某人工湖飼養(yǎng)2周內(nèi)先后發(fā)病，且其中1只死亡。根據(jù)臨床癥狀、病理變化、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果及小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果確診該病死天鵝為維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌混合感染，并對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；綿羊血，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康綿羊；革蘭氏染液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片由本實(shí)驗(yàn)室參考?xì)W盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(EUCAST 2017)自行制備并低溫保存；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、2×TaqPCR Mix，Gen Star公司產(chǎn)品；引物合成和產(chǎn)物測(cè)序由西安擎科生物公司完成；

1.1.2 主要儀器 細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司產(chǎn)品；XP基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；金屬浴恒溫器，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)菌采集該病死天鵝病變較為嚴(yán)重的組織器官，包括肺臟、肝臟和十二指腸；昆明系SPF級(jí)小鼠，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查與病理剖檢 對(duì)天鵝發(fā)病情況及臨床癥狀進(jìn)行問(wèn)診和視珍，并對(duì)死亡天鵝進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。

1.2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

1.2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢 無(wú)菌采集該病死天鵝的肺臟、肝臟和十二指腸，分別接種于血平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，擇取優(yōu)勢(shì)菌再進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌落特征，并挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察染色特性及菌體形態(tài)。

1.2.2.2 生化鑒定 挑取分離菌株純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、蛋白胨水(加靛基質(zhì)1滴～2滴)、磷酸鹽葡萄糖胨水(加MR試劑1滴)等細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，于37 ℃ 培養(yǎng)18 h ～ 24 h，觀察反應(yīng)并記錄，結(jié)果參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版進(jìn)行判斷。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)煮沸裂解法制備分離菌株DNA，用16S rRNA基因通用引物對(duì)1號(hào)和2號(hào)分離菌株DNA進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并核驗(yàn)?zāi)康臈l帶后，送由西安擎科生物公司測(cè)序，然后將所得序列提交NCBI官網(wǎng)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，并選取數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性較高的部分菌株序列，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用大腸埃希氏菌種特異性鑒定引物對(duì)3號(hào)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2.3 小鼠致病性試驗(yàn) 分別挑取各分離菌株的純培養(yǎng)物于無(wú)菌生理鹽水中制備細(xì)菌懸液，然后利用細(xì)菌濁度儀將各菌液含菌量調(diào)至約1.5×108CFU/mL。將12只小鼠隨機(jī)分為4組(n=3)，對(duì)照組小鼠每只腹腔注射0.2 mL無(wú)菌生理鹽水，試驗(yàn)組分別為維氏氣單胞菌感染組、弗氏檸檬酸桿菌感染組和大腸埃希氏菌感染組，每組小鼠分別腹腔注射0.2 mL對(duì)應(yīng)菌液，然后于相同條件下飼養(yǎng)，觀察小鼠狀態(tài)及死亡情況，如有死亡立即對(duì)其進(jìn)行病理解剖并采取臟器進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)照組小鼠予以相同處理。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)3株分離菌株進(jìn)行17種抗菌藥物的敏感性檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(EUCAST)制定的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行。藥物敏感程度判斷參考EUCAST公布的獸用抗菌藥物的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與病理變化

從陜西藍(lán)田某地共購(gòu)進(jìn)4只天鵝，飼養(yǎng)2周內(nèi)先后均發(fā)病，其中1只死亡，發(fā)病天鵝表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退，腹瀉癥狀明顯，肛門處羽毛被糞便污染。對(duì)死亡天鵝進(jìn)行病理剖檢發(fā)現(xiàn)十二指腸起始端有暗紅色出血灶，黏膜表面散在出血和充血；肝臟右葉被膜有多量纖維素附著，與腹氣囊粘連；脾臟被膜面可見(jiàn)兩個(gè)黃白色壞死灶；肺臟右側(cè)被膜面有多量纖維素覆蓋；心包膜有多量纖維素滲出，與右側(cè)胸內(nèi)膜粘連，心包腔積液，且混有黃色團(tuán)塊樣物質(zhì)；右側(cè)腹氣囊纖維素滲出。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及病理變化，初步懷疑為大腸桿菌病和(或)其他細(xì)菌性疾病。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 菌落特征與細(xì)菌形態(tài) 從該天鵝肺臟、肝臟和十二指腸共分離到3種細(xì)菌，分別命名為1號(hào)分離菌株、2號(hào)分離菌株和3號(hào)分離菌株。1號(hào)分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成灰白色、邊緣整齊、表面光滑的菌落，能形成β溶血環(huán)(圖1-1a)；革蘭氏染色陰性，菌體呈短粗桿狀，兩短鈍圓(圖1-1b)。2號(hào)分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成灰白色、中央稍隆起、表面光滑、黏稠的菌落(圖1-2a)；革蘭氏染色陰性，菌體呈直桿狀，兩短鈍圓(圖1-2b)。3號(hào)分離菌株的菌落形態(tài)與1號(hào)分離菌株相似，但無(wú)溶血現(xiàn)象(圖1-3a)；革蘭氏染色陰性，菌體呈長(zhǎng)桿狀，兩短鈍圓(圖1-3b)。

1a、1b.1號(hào)分離菌株；2a、2b.2號(hào)分離菌株；3a、3b.3號(hào)分離菌株

2.2.2 生化鑒定結(jié)果 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，1號(hào)分離菌株生化結(jié)果符合維氏氣單胞菌生化特性，初步表明其為維氏氣單胞菌。2號(hào)分離菌株生化結(jié)果符合弗氏檸檬酸桿菌特性，初步表明其為弗氏檸檬酸桿菌。3號(hào)分離菌株生化結(jié)果符合大腸埃希氏菌特性，初步表明其為大腸埃希氏菌。

表2 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 1號(hào)分離菌株和2號(hào)分離菌株的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，約在1 300 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與目的條帶大小一致(圖2)。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果表明1號(hào)分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已登錄的多個(gè)維氏氣單胞菌的相似度均在99.0%以上，2號(hào)分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已登錄的多個(gè)弗氏檸檬酸桿菌的相似度均在97.98%以上，分別各選取3株同源性較高的菌株序列，以沙門氏菌作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，1號(hào)分離菌株與維氏氣單胞菌聚為一支，表明1號(hào)分離菌株為維氏氣單胞菌。2號(hào)分離菌株與弗氏檸檬酸桿菌聚為一支，表明2號(hào)分離菌株為弗氏檸檬酸桿菌。3號(hào)分離菌株的大腸埃希氏菌PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性(圖4)，表明3號(hào)分離菌株為大腸埃希氏菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;+.陽(yáng)性對(duì)照；1.1號(hào)分離菌株；2.2號(hào)分離菌株；-.陰性對(duì)照

圖3 分離菌株16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;+.陽(yáng)性對(duì)照；3.3號(hào)分離菌株；-.陰性對(duì)照

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

注射菌液12 h后，維氏氣單胞菌感染組、弗氏檸檬酸桿菌感染組、大腸埃希氏菌感染組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)遲緩、扎堆、腹瀉等癥狀，對(duì)照組小鼠無(wú)明顯癥狀。18 h ～ 36 h，維氏氣單胞菌感染組小鼠死亡2只，弗氏檸檬酸桿菌感染組和大腸埃希氏菌感染組小鼠各死亡1只，其余小鼠2周內(nèi)正常存活。對(duì)死亡小鼠及對(duì)照組小鼠剖檢，3個(gè)組試驗(yàn)組小鼠的病理變化主要表現(xiàn)在小腸、肝臟、肺臟和脾臟(圖5)。3個(gè)組試驗(yàn)組小鼠的小腸(以十二指腸為例)，均表現(xiàn)嚴(yán)重水腫，并伴有不同程度出血(圖5 A1 B1 C1 D1)，其中以弗氏檸檬酸桿菌感染組最為嚴(yán)重(圖5 C1)。弗氏檸檬酸桿菌感染組小鼠的肝臟以充血、潮紅為主要特點(diǎn)(圖5 C2)，而維氏氣單胞菌感染組(圖5 B2)與大腸埃希氏菌感染組(圖5 D2)小鼠的肝臟以淤血、暗紅為主要特點(diǎn)。3個(gè)組試驗(yàn)組小鼠的肺臟均表現(xiàn)不同程度出血(圖5 A3 B3 C3 D3)，脾臟均表現(xiàn)不同程度淤血腫大(圖5 A4 B4 C4 D4)。將3個(gè)組試驗(yàn)組小鼠的上述病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)后，可分別再次獲得各組對(duì)應(yīng)感染菌?？傊?，該結(jié)果表明3株分離菌株對(duì)小鼠均有一定致病性。

A1、A2、A3、A4.對(duì)照組小鼠十二指腸、肝臟、肺臟、脾臟；B1、B2、B3、B4.維氏氣單胞菌感染組小鼠十二指腸、肝臟、肺臟、脾臟；C1、C2、C3、C4.弗氏檸檬酸桿菌感染組小鼠十二指腸、肝臟、肺臟、脾臟；D1、D2、D3、D4.大腸埃希氏菌感染組小鼠十二指腸、肝臟、肺臟、脾臟

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3株分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。該維氏氣單胞菌分離株對(duì)頭孢噻呋鈉、鏈霉素、慶大霉素、替米考星、恩諾沙星敏感，對(duì)阿莫西林、復(fù)方阿莫西林、氨芐西林等12種藥物耐藥。該弗氏檸檬酸桿菌分離株對(duì)鏈霉素、慶大霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、金霉素敏感，對(duì)替米考星中介，對(duì)阿莫西林、復(fù)方阿莫西林、氨芐西林等10種藥物耐藥。該大腸埃希氏菌分離株對(duì)鏈霉素、慶大霉素敏感，對(duì)恩諾沙星中介，對(duì)阿莫西林、復(fù)方阿莫西林、氨芐西林等14種藥物耐藥。該結(jié)果表明3株分離菌株均已產(chǎn)生嚴(yán)重的多重耐藥性，建議使用鏈霉素或慶大霉素等敏感藥物對(duì)發(fā)病天鵝進(jìn)行治療。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在臨床檢查和病理剖檢的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)該病死天鵝進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定、16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序和PCR檢測(cè)，結(jié)果從天鵝臟器中分離到3種細(xì)菌，分別為維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌，小鼠致病性試驗(yàn)表明3株分離菌株均有致病性，且都能造成小鼠腸道嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉，該結(jié)果與天鵝疾病特征有共同之處，因此最終確診該病死天鵝為維氏氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的混合感染。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株分離菌株均已產(chǎn)生嚴(yán)重的多重耐藥性，針對(duì)其治療可選擇的敏感藥物種類較少，給臨床防控帶來(lái)較大困難。

在水體環(huán)境中，維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌廣泛存在，且在夏秋兩季繁殖最快，在水體惡化或動(dòng)物機(jī)體免疫力降低時(shí)，動(dòng)物感染風(fēng)險(xiǎn)增大且死亡率增高[2,11]。天鵝為大型水禽，喜歡群棲在湖泊和沼澤地帶，主要以水生植物為食。天鵝的生活特性決定其不可避免會(huì)受到維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌的健康威脅。本病例中的天鵝飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)人工湖，該湖為死水湖，春夏之際水溫不斷升高導(dǎo)致各種細(xì)菌大量繁殖，且伴隨多次降雨后地面維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌大量滋生并隨水流入湖，水質(zhì)持續(xù)惡化。飲用污染水源，對(duì)天鵝健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，且在新的環(huán)境應(yīng)激下機(jī)體抵抗力有所下降時(shí)，相關(guān)病原菌便會(huì)“乘虛而入”引起天鵝發(fā)病，所以應(yīng)避免天鵝群飲用污染水源，并做好飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體抵抗力。同時(shí)，本病例提示在對(duì)天鵝等珍禽引進(jìn)前要對(duì)水體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)并最好進(jìn)行階段性藥物預(yù)防。

維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌都是淡水魚(yú)類細(xì)菌性疾病的常見(jiàn)病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也都是重要的人、獸及水生生物共患病原菌，威脅著人類健康。近年來(lái)越來(lái)越多的病例報(bào)道表明其兩者的流行呈上升趨勢(shì)，且危害不斷加重，耐藥性也不斷增強(qiáng)，可能是尚未被人們充分認(rèn)識(shí)的病原菌，應(yīng)當(dāng)提高對(duì)其重視程度[5,9,12]。