馬曉宇，武小虎，王勝義，楊 潔，沈文祥，宋朋杰，楊 英，嚴(yán)作廷*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

細胞焦亡(pyroptosis)主要發(fā)生于炎癥感染過程中，焦亡后的細胞表現(xiàn)為細胞膜破裂，細胞內(nèi)容物釋放而出并伴隨大量炎癥因子的成熟和釋放。因此，細胞焦亡又被稱為細胞炎癥性壞死。細胞焦亡是機體一種重要的天然免疫反應(yīng)，它是由細胞上的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別感染病原體的相關(guān)模式分子(pathogen-associated model pattern,PAMP)，或者機體自身的損傷相關(guān)模式分子(damage-associated model pattern,DAMP)，進而激活炎癥小體(inflammasome)免疫復(fù)合物，導(dǎo)致炎癥因子，主要為白介素18(interleukin 18，IL-18)和白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)由前體形式轉(zhuǎn)為成熟形式。最后切割具有打孔功能的Gasdermin蛋白家族相關(guān)蛋白導(dǎo)致細胞膜破裂，大量細胞內(nèi)容物和炎癥因子被釋放，同時可以招募炎癥細胞聚集，進而清除病原微生物，保護宿主機體。但過度的細胞焦亡也會對機體有害，可能導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生[1-2]。目前研究表明，炎癥小體誘導(dǎo)細胞焦亡的方式有兩種，分別被稱為經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體通路。多種細菌均可誘導(dǎo)細胞焦亡，這2種信號通路在不同的細菌性感染中發(fā)揮相應(yīng)的作用[3]。

1 經(jīng)典炎癥小體通路

經(jīng)典的炎癥小體通路通常由以下幾個部分組成：模式識別受體，接頭蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)。由于經(jīng)典炎癥小體通路效應(yīng)蛋白均為caspase-1，該通路又可稱為caspase-1依賴性炎癥小體通路。它們在PAMP或者DAMP的刺激下激活后，可將炎癥因子IL-18和IL-1β的前體形式變?yōu)槠涑墒煨问?，同時，炎癥小體還將切割打孔蛋白GSDMD，使其C端和N端分離并在細胞膜上打孔，導(dǎo)致細胞膜破裂，成熟的炎癥因子釋放。

1.1 模式識別受體

模式識別受體是指先天免疫識別病原入侵并檢測組織穩(wěn)態(tài)的一系列受體。與適應(yīng)性免疫應(yīng)答不同，PRRs主要識別微生物表面的統(tǒng)一的模式或者保守的序列。這些模式識別受體包括Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)、Nod樣受體(NOD-like receptors,NLRs)、C型凝集素受體(C-type lectin receptor,CLRs)、RIG樣受體(RIG-like receptors,RLRs)、Pyrin蛋白、DNA識別受體黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)和細胞內(nèi)LPS受體Caspase-11(4/5)。它們有的表達于細胞表面(部分TLRs和CLRs等)，檢測細胞外環(huán)境刺激；有的表達于細胞內(nèi)部(NLRs和RLRs等)，可被細胞一些內(nèi)源性炎癥因子激活。其中，與經(jīng)典炎癥小體通路密切相關(guān)的模式識別受體分別是TLR(調(diào)控作用)、部分NLR、AIM2和Pyrin(直接組成)[4-6]。

Toll樣受體是目前研究最多的一類模式識別受體，它是一類跨膜受體，其結(jié)構(gòu)可分為3個部分：細胞外為富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine rich repeat,LRR)，跨膜部分富含半胱氨酸；胞漿內(nèi)區(qū)域與白介素1(interleukin 1，IL-1)受體同源。其主要表達于細胞膜表面(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6)，部分表達于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)體膜上(TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)。不同的TLR特異性識別一類PAMP，包括細菌鞭毛蛋白、脂多糖、肽聚糖、單鏈RNA、雙鏈RNA等。受體和配體結(jié)合后，可以通過MyD88、TRIF等激活NF-κB信號通路，進而激活細胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。細胞因子激活后可以進一步調(diào)控炎癥小體信號通路相關(guān)蛋白的表達和激活。同時，TLR信號通路激活還可以參與機體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，對效應(yīng)T細胞的發(fā)生、分化、記憶細胞形成和抗體的產(chǎn)生等具有多層面的調(diào)控能力[7-8]。

Nod樣受體是一類表達于細胞內(nèi)部的受體，其家族的特點是含有一個中央約束力的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)，其側(cè)翼通常為帶著LRR的C端和含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)或熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain,PYD)的N端。根據(jù)功能可將NLR家族分為2組：一組包括NOD1和NOD2，激活各種轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB、MAPK等)，誘導(dǎo)促炎因子(抗菌肽、干擾素等)產(chǎn)生；另一組包括NLRP3、NLRC4等通過LRR接受刺激信號，介導(dǎo)蛋白復(fù)合物炎癥小體的裝配，其中NLRC4可通過N端的PYD與ASC結(jié)合，間接招募Caspase，也可通過CARD直接招募效應(yīng)蛋白，而NLRP3則必須依賴ASC才能招募效應(yīng)蛋白。另有研究表明，非典型NLR蛋白像AIM2和PYRIN蛋白，也具有形成炎癥小體并引起下游分子激活的功能，且其方式與NLR蛋白相同[9-10]。

細菌感染時可以通過不同的PAMP被相應(yīng)的PRRs識別，進而誘導(dǎo)細胞焦亡來清除細菌。如產(chǎn)單核細胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)感染機體或細胞時，細胞外的LM主要被TLRs識別，胞內(nèi)的LM形式如鞭毛蛋白、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)等被NLRs和AIM2識別[11-13]；沙門氏菌(Salmonella)感染時，可通過自身形成的囊泡破裂釋放到巨噬細胞胞質(zhì)中，其鞭毛蛋白和T3SS可被NOD樣受體NLRC4識別，另有研究證明NLRP3也參與了沙門氏菌的識別過程，可與NLRC4發(fā)揮協(xié)同作用[14-15]；同樣，嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)也可通過其鞭毛蛋白被NLRC4識別[16]。這些受體被激活后，可通過ASC招募或直接招募Pro caspase-1并將其切割成活化形式，活化后的caspase-1可通過切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體使其成熟并分泌到細胞外，從而引起細胞焦亡并招募炎性細胞聚集，擴大炎癥反應(yīng)，進一步激活宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，最終清除感染的病原菌[17]。

1.2 炎癥小體的激活

炎癥小體的激活是細胞焦亡過程的核心反應(yīng)。在PAMP和DAMP的作用下，受體的C端(LRR)接收到相關(guān)信號，受體發(fā)生寡聚化(oligomerization)同時其N端(PYD)與接頭蛋白(ASC)的N端(PYD)結(jié)合，ASC的C端(CARD)可以招募caspase-1前體(pro-caspase-1)，使其發(fā)生自身切割后形成,3個獨立的結(jié)構(gòu)：p10、p20和CARD結(jié)構(gòu)域。caspase-1的活性形式是由2個p10和2個p20形成的異四聚體(也有一些受體N端不含PYD而直接含有CARD，這些受體可不通過ASC直接招募并活化caspase-1)。此時，炎癥小體免疫復(fù)合物形成并可以將細胞因子(IL-18、IL-1β)由前體形式轉(zhuǎn)化為成熟形式并引發(fā)細胞焦亡[18]。

志賀桿菌(Shigella)感染巨噬細胞后，誘導(dǎo)的細胞程序性死亡具有核固縮、DNA斷裂，細胞膜完整性受損，通透性改變，胞質(zhì)空泡化，線粒體膜電位降低和IL-1β分泌增多等細胞焦亡的特征。志賀桿菌誘導(dǎo)細胞焦亡具有其獨特的特征，與傳統(tǒng)炎癥小體激活方式有所區(qū)別，這一過程是由志賀桿菌的T3SS效應(yīng)蛋白IpaB誘導(dǎo)caspase-1激活引起的[19]。另有研究表明，志賀桿菌的T3SS可以分泌IpaH7.8 E3泛素連接酶，使球蛋白(glomulin,GLMN)泛素化并降解，從而通過該途徑誘導(dǎo)巨噬細胞的炎癥小體激活和細胞焦亡[20]。

1.3 效應(yīng)蛋白Caspase

Caspases通常以酶原的形式被表達出來，發(fā)揮功能時需要被激活。Caspase蛋白N端為Caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)或者死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effector domain,DED)，其后為2個亞基(p10和p20)。Caspase激活時進行自切割后可形成,3個獨立的結(jié)構(gòu)：p10、p20和CARD結(jié)構(gòu)域。caspase-1的活性形式是由2個p10和2個p20形成的異四聚體。Caspase家族可根據(jù)功能不同而分為凋亡起始Caspase亞家族，包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10；凋亡執(zhí)行Caspase亞家族，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7；炎癥Caspases亞家族，包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11、Caspase-13和Caspase-14[21-22]。

近年來研究表明，除了傳統(tǒng)的炎癥caspase蛋白，其他的caspase蛋白如Caspase-8也能在細菌感染引起的細胞焦亡過程中發(fā)揮重要作用[23]。耶爾森氏菌(Yersinia)感染過程中，其T3SS會分泌許多外膜蛋白(Yersinia outer membrane protein,Yops)，這些外膜蛋白具有多種功效：其中YopJ可以抑制MAP激酶家族成員TGF-β激活的激酶1(TGF-β activated kinase 1,TAK1)，激活caspase-8從而切割GSDMD導(dǎo)致細胞焦亡[24]；另有研究表明，耶爾森氏菌的T3SS可激活NLRP3和NLRC4炎癥小體進而導(dǎo)致caspase-1依賴的細胞焦亡，caspase-8也可以調(diào)控這一過程[25]。

1.4 打孔蛋白Gasdermin

關(guān)于細胞焦亡的研究很早就出現(xiàn)，但以前一直將其和細胞凋亡相混淆，有關(guān)炎癥小體具體如何介導(dǎo)細胞焦亡的機制直到2015年才通過邵峰實驗室[26]和Vishva Dixit實驗室[27]的文章揭示：細胞焦亡是由于Gasdermin D(GSDMD)蛋白被活化的Caspase切割激活，使蛋白質(zhì)N端部分在細胞膜上寡聚并聚集成孔引起細胞膜破裂而導(dǎo)致的。Gasdermin家族其他成員包括Gasdermin A、Gasdermin B、Gasdermin C、Gasdermin D、Gasdermin E和DFNB59。目前研究表明，除了DFNB59，Gasdermin家族其他蛋白均具有細胞打孔功能，GSDMD為細胞焦亡主要執(zhí)行蛋白，至于Gasdermin家族其他蛋白的具體功能和激活機制，目前同樣有研究表明他們可以通過相關(guān)效應(yīng)蛋白caspase的激活來介導(dǎo)細胞焦亡，但其具體的信號通路尚有待于進一步的研究進行揭示[28-30]。

2 非經(jīng)典炎癥小體通路

非經(jīng)典炎癥小體通路又稱為Caspase-1非依賴性炎癥小體通路，因其效應(yīng)蛋白為細胞內(nèi)的LPS直接受體Caspase-11(4/5)。以往的研究認(rèn)為，LPS只能在胞外刺激TLR4受體進而通過NF-κB信號通路或經(jīng)典炎癥小體信號通路來引起炎癥反應(yīng)，但近來研究發(fā)現(xiàn)，在細胞內(nèi)存在一種LPS直接受體Caspase-11(4/5)。其表達依賴TLR2/3/4受體激活，但其活化則必須有細胞內(nèi)LPS的參與，Caspase-11(4/5)的活化也不同于Caspase-1的自身切割，而是發(fā)生寡聚化。研究表明，Caspase-11(4/5)的活化依賴與LPS的六酰基脂質(zhì)A和自身CARD結(jié)構(gòu)域。但這些研究中的LPS均是通過轉(zhuǎn)染(電轉(zhuǎn)或者脂質(zhì)體)而非正常途徑進入細胞內(nèi)[31-33]。因此，關(guān)于LPS在生理狀態(tài)下如何進入細胞成為了研究非經(jīng)典炎癥受體信號通路的關(guān)鍵。目前，關(guān)于LPS入胞的猜想有一下2種：①細菌感染過程中，細菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMV)中含有高濃度的LPS，可在巨噬細胞網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下形成吞噬體進入細胞后經(jīng)由鳥苷酸結(jié)合蛋白(Guanylate binding protein,GBP)破壞吞噬體囊泡，使LPS暴露在細胞質(zhì)內(nèi)。②LPS結(jié)合蛋白LBP在LPS入胞中發(fā)揮了重要作用，但其具體機制尚不完全清楚[34-36]。

非經(jīng)典炎癥小體的通路構(gòu)成比較簡單，僅有入胞后的LPS作為刺激物，caspase-11(鼠)或caspase-4/5(人)既作為LPS的模式識別受體，又同時可作為效應(yīng)蛋白直接激活以切割GSDMD。但非經(jīng)典炎癥小體通路不能導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子(IL-18、IL-1β)的成熟，必須依賴經(jīng)典炎癥小體通路的作用。因此，同樣有人進行相關(guān)研究，認(rèn)為非經(jīng)典炎癥小體通路同樣可以參與經(jīng)典炎癥小體通路中相關(guān)免疫復(fù)合物(通過K+外流等)的激活[37]。

LPS是革蘭氏陰性菌的經(jīng)典PAMP，研究表明：LPS轉(zhuǎn)染進入細胞后，可以直接激活caspase-11，誘導(dǎo)細胞焦亡[33]。

3 結(jié)語與展望

細胞焦亡作為一種新的細胞程序性死亡方式，近年來被許多學(xué)者研究，對其分子機制及在細菌感染中的作用有了一定的認(rèn)識?？傮w來說，細胞焦亡可在一定程度上抵御細菌的感染，但過度的細胞焦亡可能導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生，對機體造成極大的傷害。本課題組主要進行關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜炎的分子病理機制及其治療方法的研究，而奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病因素就是細菌感染。近年來，已有相關(guān)研究[38]表明，奶牛子宮內(nèi)膜炎的分子病理機制可能與細胞焦亡有關(guān)，但仍有許多問題尚未解決，有待于進一步的研究。本課題組擬在前人研究的基礎(chǔ)上進一步研究子宮內(nèi)膜炎與細胞焦亡的具體分子病理機制，并試圖找出相應(yīng)的治療手段。