劉政麟 裴仕隆 韓 宇 陳周昊 審校 劉 悅 丁之德

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2019 級臨床醫(yī)學(xué)八年制；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系

tsRNA（tRNA-derived small RNAs）是近幾年受到高度關(guān)注的具有基因調(diào)節(jié)功能的一類非編碼小RNA，其來源于tRNA，且屬于tRNA 在生理或病理?xiàng)l件下切割后產(chǎn)生的新的小RNA。 早期有關(guān)tsRNAs 結(jié)構(gòu)和功能的研究認(rèn)為，tsRNAs 作為一種RNA 損傷后的降解產(chǎn)物，只是隨機(jī)的核苷酸序列，本身沒有與生理代謝過程相關(guān)的結(jié)構(gòu)或功能特性； 同時， 由于這些small non-cpdomg RNA 片段數(shù)量太少，推測其對早期胚胎發(fā)育并不發(fā)揮重要作用。 然而， 近年來的研究表明，tsRNAs 并不是無意義的隨機(jī)片段， 而是由特定的酶識別特定的位點(diǎn)， 從而產(chǎn)生的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的非編碼小RNAs。 隨著研究的深入，tsRNAs 在細(xì)胞活動中的重要性逐漸被發(fā)現(xiàn)。 tsRNAs 對多種生理代謝過程具有調(diào)控功能，如在細(xì)胞增殖和凋亡、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、核糖體生物合成、免疫反應(yīng)、精子RNA 介導(dǎo)的表觀遺傳等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 本文主要綜述了tsRNA 的產(chǎn)生、修飾、參與精子介導(dǎo)的跨代遺傳等研究進(jìn)展。

一、tsRNA 的來源與分類

（一）tsRNA 的來源

20 世紀(jì)70 年代末，tsRNA 被認(rèn)為是tRNA 隨機(jī)降解的產(chǎn)物，并未引起足夠的重視。 隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們在細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動物中進(jìn)一步研究并分析了tsRNA 的產(chǎn)生環(huán)境。 在tsRNA 產(chǎn)生過程中， 存在著多種復(fù)雜的處理程序，tRNAs 首先被RNA 聚合酶III 轉(zhuǎn)錄成前體tRNA 副本，隨后在RNase P和RNaze Z 的加工后產(chǎn)生tsRNA， 根據(jù)核酸內(nèi)切酶切割的位置不同可以對tsRNA 進(jìn)行分類， 此過程的副產(chǎn)物也可以作為單獨(dú)的tsRNA 參與細(xì)胞的生理活動[1-4]。

（二）tsRNA 分類

根據(jù)酶切割位點(diǎn)不同，tsRNA 大致可分為五類：

1.5’tsRNA，這是含量最豐富的一類tsRNA，來源于成熟tRNA 的5’端。 在正常條件下，由Dicer 或其他核酸內(nèi)切酶切割tRNA D 環(huán)與反密碼子環(huán)之間的莖可產(chǎn)生5’tsRNA，而在低氧、高輻射、蛋白質(zhì)缺乏、細(xì)菌病毒感染等應(yīng)激狀態(tài)下，由angiogenin、RNY,Ro60-Associated Y1、RNase L 等切割tRNA 反密碼子環(huán)也可產(chǎn)生5’tsRNA。 5’tsRNA 通常包含tRNA 的第一個核苷酸，通常終止于tRNA 的反密碼子環(huán)。 不同來源的5’tsRNA 大小不同， 如human embryonic kidney cells 293 細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和Halophage Archaea 的5’tsRNA 大小差異顯著。 5’tsRNA 大小一般在30-35 nt（核苷酸）之間，但也存在一些規(guī)模較小的部分，這些較小的5’tsRNA 進(jìn)一步分為3 個亞組，18-20 nt 片段，25 nt 片段和27-30 nt 片段。 這些小RNA 的5’端和tRNA 的5’端高度相似，這表明3’端核酸內(nèi)切酶的剪切位置決定了這些片段的大小[5-7]。

2.3’tsRNA。 3’tsRNA 來源于成熟的3’末端，其中常含有標(biāo)志性的CCA 序列。 在正常與應(yīng)激狀態(tài)下，TΨC 環(huán)以及反密碼子環(huán)和TΨC 環(huán)之間的莖可被Dicer 或其他核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生3’tsRNA, 可根據(jù)它們的大小分為3’tsRNA 或3’halves(35-45 nt)和較小的

tRF-3s(18-20 nt)[5-7]。

3.tRNA 前體的3’拖車序列。 RNase P 和RNase Z分別在成熟過程中處理細(xì)胞核中5’ 端前導(dǎo)序列和3’端尾部序列的前tRNA， 生成的30 個拖尾序列變成14-48 nt 長的tsRNA。 它們的5’末端在tRNA 基因組序列的3’末端之后開始，而它們的3’末端是由多尿苷尾部形成，即RNA pol III 終止信號。 雖然該類tsRNA 通常被認(rèn)為是在細(xì)胞核中產(chǎn)生， 但亦有報道顯示， 這類tsRNA 中的tRNA-related fragment-1001 是由ElaC Ribonuclease Z 2 產(chǎn)生，ELAC2 是一種由前列腺癌易感基因編碼的tRNA 3’內(nèi)切酶[8]。這一發(fā)現(xiàn)提示該類3’拖車序列(Trailer Sequence)可能起源于多條生物發(fā)生途徑。

4.第四類是tRNA 半體，這是一類在tRNA 的反密碼子環(huán)處切割產(chǎn)生，且大小為30-40 nt 的tsRNA，因它們幾乎是其前體tRNA 長度的一半，故稱為tRNA 半體（也被稱為tRNA halves）。tiRNA 可簡單分為兩類(即5’tiRNA 和3’tiRNA)。 5’tiRNA 的5’ 末端對應(yīng)于前體tRNA 的5’末端，而3’末端位于前體tRNAs 的反密碼子環(huán)內(nèi)。因此，3’tiRNA 的3’端與前體tRNA 的3’端的CCA 序列相匹配， 它們的5’ 端是反密碼子環(huán)的一部分。 參與tiRNA 生成的主要酶是血管生成素， 它是RNase A 超家族的成員。 在正常情況下，血管生成素定位于細(xì)胞核內(nèi)，或與血管生成素抑制劑ribonuclease inhibitor 1 一起以非活性形式存在。 然而，在應(yīng)激條件下，血管生成素從細(xì)胞核釋放或從RNH1 解離， 并在其反密碼子環(huán)處切割tRNA 以生成tiRNAs，但也有報道稱，在亞砷酸鹽處理的條件下， 加工tRF5-AlaCGC(tRNA半體)需要血管生成素和Disher 共同作用。

5.其他tsRNA，其來源于tRNA 或tRNA 前體其他區(qū)域的切割。 這些其他類型的tsRNA，也稱為I-TRF 或TRF-2， 包括其前體tRNA， 且含有反密碼子的內(nèi)部區(qū)域；它們的長度可變。最后，還有一組tsRNA，其5’端對應(yīng)于前tRNA 的前導(dǎo)序列5’端，而其3’端對應(yīng)于反密碼子環(huán)的5’端外顯子。 目前這兩種類型的tsRNA 產(chǎn)生的詳細(xì)原理還未見[9]。

由上述可見，tsRNA 可通過核酸內(nèi)切酶在tRNA 特定位點(diǎn)上的裂解生成，這些小RNA 不是簡單的降解產(chǎn)物， 并且不同類型的tsRNA 具有不同的生物學(xué)發(fā)生機(jī)制，并且也可能有不同的生物學(xué)作用。

二、tsRNA 研究技術(shù)

目前對tsRNA 的研究主要集中在其對某些疾病或生理現(xiàn)象的影響過程，通常包括tsRNA 的分離純化、定量測量、特異性地增加或減少。 如首先對不同狀態(tài)的組織進(jìn)行tsRNA 的分離和純化， 以獲取特定的研究對象中所富集的tsRNA， 然后通過生物化學(xué)技術(shù)分析不同的tsRNA 成分， 篩選可能會對生理功能產(chǎn)生重要影響的tsRNA 種類。最后并對此進(jìn)行驗(yàn)證，并通過特異性地提高或降低tsRNA 的含量， 觀察細(xì)胞或組織所發(fā)生的變化而得出結(jié)論。 在這期間，為了得到高效且準(zhǔn)確的研究結(jié)果，現(xiàn)主要的應(yīng)用方法包括micro array，RNA-seq，Northern blotting，Cross-linking ligation and sequencing of hybrids(CLASH)等。

（一）Micro array 是一種高通量檢測tsRNA 表達(dá)的有效方法，其主要是通過制作特定基因芯片對目標(biāo)tsRNA 進(jìn)行含量方面的分析。其特點(diǎn)是擁有極高的特異性以及靈敏度。 Schena 等利用不同種屬的cDNA 與熒光探針雜交， 在鼠與酵母對照組中未發(fā)現(xiàn)擬南芥基因表達(dá)陽性情況[10]，以此來驗(yàn)證該技術(shù)。 同時De Saizieu 等人證明其靈敏度強(qiáng)于Northern 雜交， 錯誤的重復(fù)率低于25%[11]， 但其在針對sncRNAs 測量方面存在對小RNA 覆蓋面不全這一不可忽視的問題。 Balatti V 等人通過將腫瘤樣本中總RNA 與特定的RNA 樣品進(jìn)行雜交后確定了tsRNA 的表達(dá)與腫瘤中原癌基因表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)而發(fā)明了一種基于tsRNA 的診斷技術(shù)[12]。Farina NH等人在驗(yàn)證四種tsRNA （ts-19，ts-29，ts-46 和ts-112）可能與抑癌基因RUNX Family Transcription Factor 1 的抑制性表達(dá)相關(guān)過程中也使用了類似的雜交原理[13]。

（二）RNA-sequencing 技術(shù)是micro array 技術(shù)的迭代產(chǎn)品，其將目標(biāo)RNA 純化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行測序。 技術(shù)的主要難點(diǎn)在于sncRNA 片段的選取以及基因組數(shù)據(jù)的完整性。 前者需要考慮tsRNA 片段大小范圍及該范圍內(nèi)目標(biāo)RNA 純度。 tRFs 首先在17-26nt小RNA 序列區(qū)段被發(fā)現(xiàn)[12]，但該非編碼RNA 大部分長度大于30nt。 至于后者，因無法確定其他未探明區(qū)段是否存在tsRNA，很可能造成假陰性結(jié)果，即產(chǎn)生大量未與已知基因組匹配的序列，其含量可能高達(dá)70%[13]。

（三）Northern blotting 是檢測tRF 和tiRNA 的一種重要方法。 將RNA 電泳分離后與相應(yīng)被標(biāo)記的探針雜交，通過信號反應(yīng)顯示其含量。 該技術(shù)費(fèi)用較低，操作簡便，但存在純度較低，易出現(xiàn)未知RNA 鏈污染的情況。 Kim HK 等人[4]在大鼠原位肝細(xì)胞癌模型中研究LeuCAG3′tsRNA 誘導(dǎo)快速分裂細(xì)胞凋亡的作用時采用了這一方法， 并最終驗(yàn)證得到了一條較為清晰的分子作用機(jī)制通路。 由于tsRNA 在分子間相互作用關(guān)系中所處的獨(dú)特位置，可能會建立另一種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制，同時，利用這一機(jī)制，可以在不同的生理狀態(tài)下微調(diào)基因表達(dá)，即為治療癌癥新的潛在性靶點(diǎn)。

需要指出的是， 在RNA 提取與含量分析實(shí)驗(yàn)中，通常是多種檢測方式共同使用。Northern blot 常用于初期目標(biāo)RNA 提取鑒定與目標(biāo)tsRNA 片段長短定位，micro array 與RNA-seq 則主要應(yīng)用于特異大小tsRNA表達(dá)情況的精準(zhǔn)測量。

三、tsRNA 修飾調(diào)節(jié)

tsRNA 是經(jīng)特定的酶在tRNA 特定的位置進(jìn)行切割后產(chǎn)生，因此tsRNA 可以攜帶tRNA 的多種RNA 修飾。 這些RNA 修飾一方面可以增強(qiáng)或者抑制核酸內(nèi)切酶的活性， 改變核酸內(nèi)切酶切割tRNA 的效率[14]。Donovan J 等在人類細(xì)胞中證明了tRNA 反密碼子環(huán)第34 位G 到Q 的修飾可以介導(dǎo)RNaseL 對tsRNAHis第36 位的特異性切割[15]。 在其他物種細(xì)胞如大腸桿菌tRNATyr/Asn/His/Asp 反密碼子環(huán)擺動位置的queuosine(Q34)修飾能增加RNA 酶Colicin E5 的活性；在乳酸克魯維酵母中發(fā)現(xiàn)tRNAGlu（UUC）、tRNALys（UUU）和tRNAGln（UUG）第34 位的mcm2s2U 修飾對酵素在反密碼子環(huán)擺動位置的切割非常重要。另一方面，RNA 修飾也可以調(diào)節(jié)應(yīng)激誘導(dǎo)的tsRNA 切割。 DNA（cytosine-5）-methyltransferase-like protein 2 和NOP2/Sun RNA Methyltransferase 2 介導(dǎo)的m5C 修飾， 能增加tRNA 的穩(wěn)定性；Blanco S 等人證明了m5C 的缺失增加血管生成素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶對tRNA 的剪切能力，使得tRNA容易在反密碼處被切割而產(chǎn)生更多的tsRNA[16]。

tsRNA 在經(jīng)過修飾后形成的特殊結(jié)構(gòu)會存儲遺傳信息。 Safra M 等發(fā)現(xiàn)m1A 修飾缺失會導(dǎo)致tsRNA 內(nèi)部不能正常形成堿基配對的結(jié)論基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)tsRNA 不能正常折疊成倒L 型結(jié)構(gòu)， 而產(chǎn)生意外的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其無法正常發(fā)揮作用[17]。 這些特異位點(diǎn)的改變可能會引起tsRNA 對RNA 酶消化的抵抗性，并改變其生物學(xué)功能。

四、精子tsRNA 參與父系跨代遺傳

相較于含有大量RNAs 的卵母細(xì)胞， 由于精子中sncRNAs 數(shù)量太少， 早期不認(rèn)為其在子代遺傳發(fā)育中產(chǎn)生重要作用。 近年來，該觀點(diǎn)已被修正即精子sncRNAs 在子代遺傳發(fā)育中的作用得到了初步的實(shí)驗(yàn)論證。

Chen 等人[18]通過實(shí)驗(yàn)證明父代受環(huán)境影響產(chǎn)生的獲得性性狀可以通過tsRNA 傳遞給子代。在實(shí)驗(yàn)中，通過向5 周齡F0 雄性小鼠喂食高脂肪飲食（high-fat diet,60%脂肪） 構(gòu)建父代飲食導(dǎo)致代謝紊亂的代際傳遞模型，同時向其他同期F0 雄性小鼠喂食正常飲食(normal diet,10%脂肪)構(gòu)建對照組。 喂食六個月后，高脂肪飲食組小鼠展現(xiàn)出肥胖， 葡萄糖不耐受以及胰島素耐藥等體征， 而正常飲食組小鼠各項(xiàng)體征處于正常范疇。 隨后， 將HFD 組和ND 組小鼠精子頭部分別注射到正常卵母細(xì)胞中，在胚胎發(fā)育為個體后，均正常飲食。 HFD組子代在第7 周左右展現(xiàn)出葡萄糖耐受以及胰島素抵抗力受損等表象，在第15 周時該表象愈發(fā)明顯。 值得注意的是， 將HFD 組和ND 組精子RNA 提取純化后分別注射至正常小鼠受精卵中， 得到的子代在正常飲食條件下，HFD 組子代出現(xiàn)血糖耐受性受損的表象，但對胰島素的敏感性與ND 組子代相似。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中存在一種之前未注意到的RNA 影響傳代遺傳過程。通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)比較兩個組子代RNA 發(fā)現(xiàn)，HFD 組子代相較于ND 組子代tsRNA 含量比例更高，miRNA 含量比例降低， 提示tsRNA 含量易受高脂肪飲食的影響。隨后，將兩組精子tsRNA 提純并注入正常小鼠受精卵實(shí)驗(yàn)中，注入HFD 組tsRNA 的小鼠成功表達(dá)出胰島素耐藥的特征， 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)主要為代謝相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，但具體機(jī)制仍有待研究。

RNA 修飾會對精子中tsRNA 的濃度和表達(dá)譜的變化產(chǎn)生較大的影響[7]。目前可以確定tsRNA 確實(shí)在表觀遺傳中起到重要作用。 表觀遺傳的調(diào)控按照步驟大致分為兩個部分， 其一是父代將表觀遺傳信息儲存在精子中， 其二則是子代對于遺傳信息的提取過程，即tsRNA 如何通過生化反應(yīng)途徑對子代的代謝過程產(chǎn)生影響[20]。tsRNA 在精子中的豐度和可能存在的特殊結(jié)構(gòu)是父代將環(huán)境產(chǎn)生的變化通過tsRNA 進(jìn)行表觀遺傳的主要方式。 Chen 等證明，高脂飲食能夠?qū)е聇sRNA 中的m5C、m2G 修飾的增加，也會影響tRNA 的穩(wěn)定性，導(dǎo)致tsRNA 含量發(fā)生變化，從而介導(dǎo)表觀遺傳。 DNMT2是tsRNA 產(chǎn)生的重要酶之一，其發(fā)現(xiàn)過程也頗為曲折[21]，當(dāng)科學(xué)家們終于意識到其作用位點(diǎn)位于RNA 而非DNA 之后[22]，才逐漸發(fā)現(xiàn)它的催化機(jī)制[23]。 而DNMT2敲除的小鼠不能將這種父代表型傳遞給子代， 相應(yīng)的m5C、m2G 修飾也恢復(fù)到正常水平。 DNMT2 的缺失還可以改變精子小RNA 表達(dá)譜[16,17]。

tsRNA 也可介導(dǎo)F0 母本性狀傳遞給F2 子代個體。 研究中發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)組（HFD 組）的F0 雌鼠與正常雄鼠產(chǎn)下的F1 代雄性小鼠，正常喂養(yǎng)后提取其精子總RNA 注入到受精卵中， 產(chǎn)生的F2 代小鼠相較于正常飲食喂養(yǎng)組（control diet 組）F0 代雌鼠產(chǎn)生的F2代小鼠總體以及內(nèi)臟脂肪含量更高， 同時在胰島素耐受實(shí)驗(yàn)中也會展現(xiàn)出更高的血糖水平。 在高通量測量后發(fā)現(xiàn)，HFD 暴露組的F1 代雄鼠精子tsRNA 含量相較于CTR 組更高。 因此，HFD 暴露組的F0 代雌鼠與體現(xiàn)出胰島素耐受、肥胖代謝綜合征的F2 代小鼠之間的相關(guān)性以及與正常飲食組精子tsRNA 含量之間的比較，均表明“tsRNA 可以作為載體，促進(jìn)了性狀的跨代遺傳”這一結(jié)論[19]。

五、精子tsRNA 對早期胚胎的調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，tsRNA 除了在體內(nèi)多種生理代謝過程具有重要的作用外， 其對于子代早期胚胎發(fā)育過程有關(guān)鍵的調(diào)控作用，而對這方面的進(jìn)一步探究，有助于更加全面、深入地了解精子RNA 介導(dǎo)的表觀遺傳信息在父代與子代之間的傳遞。

2016 年，Chen 等[18]通過對雄性小鼠進(jìn)行高熱量飲食誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其子代相關(guān)基因表達(dá)明顯異常，證明精子tsRNAs 的確對早期胚胎的發(fā)育過程起到了重要的作用。 2018 年，Luo 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，果蠅體內(nèi)tsRNAs 可通過互補(bǔ)序列配對識別目標(biāo)mRNA， 優(yōu)先識別并結(jié)合核糖體蛋白(ribosomal proteins)和核糖體翻譯啟動或延伸因子(IEFs)mRNA，進(jìn)行AGO2 蛋白依賴性的抑制調(diào)控，從而抑制靶基因的翻譯。 同時，該研究還發(fā)現(xiàn)，在serum starvation 條件下的果蠅體內(nèi)的5’tsRNA 而不是3’tsRNA 顯著增加，導(dǎo)致RPs 和IEFs 的翻譯合成降低[24]。2017 年，Schorn等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，在模仿表觀遺傳重編程的GC-2spd, 小鼠精母細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells）細(xì)胞中檢測到了豐富的sRNA，其與LTR- 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous Retrovius)互補(bǔ)，可以干擾轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)移，而這些sRNA 大部分來自tRNA，具有3’端CCA 核苷酸。 另一方面，該研究還發(fā)現(xiàn)，來源于tRNA3’端、長度為18nt 的tsRNAs 可以與ERV 共同競爭ERV 引物的結(jié)合位點(diǎn)(Primer Binding Site)， 如在LTR-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子復(fù)制期間，PBS 與tRNA 結(jié)合， 且高度富集于兩個最活躍的小鼠轉(zhuǎn)座子家族inhibitor of apoptosis protein 和ETn，從而對ERV 逆轉(zhuǎn)錄起到特異性的抑制作用，同時也可以對反轉(zhuǎn)座子遷移進(jìn)行特異性地抑制[25]； 而來源于tRNA3’端、長度為22nt 的tsRNAs 則可以通過轉(zhuǎn)錄后sRNA 介導(dǎo)的沉默來抑制ERVs 的表達(dá)，但長度為18nt 的3’tsRNA 則對轉(zhuǎn)錄或蛋白水平?jīng)]有影響[25]。 Conine 等提取附睪頭部和尾部的精子并將其通過Intracytoplasmic sperm injectrtion（ICSI）分別注入至正常小鼠卵母細(xì)胞。 此項(xiàng)針對受精卵與胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，在附睪頭部精子含少量tsRNA 存在的情況下， 受精卵內(nèi)部分調(diào)控因子過量表達(dá)，胚胎植入率和成活率低下。 同時，當(dāng)精子在附睪經(jīng)過一系列代謝調(diào)節(jié)后， 附睪尾部精子tsRNA含量比例增加， 所得到的受精卵與胚胎可正常進(jìn)行生理代謝，植入率和存活率均達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)。 隨后，在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中， 將tsRNA 純化后的提取物注入到上述缺陷細(xì)胞中，各項(xiàng)生理指標(biāo)又得到一定程度的改善。 由此判斷tsRNA 在胚胎正常發(fā)育中也不可缺少[26]。

六、小結(jié)與展望

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)跨代遺傳的非編碼小RNA—tsRNA。 父代通過對RNA 以及剪切后的tsRNA進(jìn)行特異性修飾， 完成精子介導(dǎo)的父代與子代之間的表觀遺傳信息傳遞。 在胚胎的早期發(fā)育過程中， 由于tsRNA 對轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移的抑制以及對核糖體合成的促進(jìn)， 可對細(xì)胞分裂、 早期分化以及凋亡產(chǎn)生重要的影響。 然而，tsRNA 介導(dǎo)的表觀遺傳具體的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。