徐艷艷，廖志銀，王珍，王首鋒，3*

（1.浙江大學 基礎醫(yī)學系，浙江 杭州 310058；2.綠城農(nóng)科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310052；3.浙江省微生物生化與代謝工程省級重點實驗室，浙江杭州 310058）

20 世紀40～80 年代是抗生素的黃金時期，多種抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用在給人們帶來健康的同時出現(xiàn)了耐藥性問題［1］?？股爻糜谂R床治療，還用于養(yǎng)殖業(yè)、食品加工業(yè)，耐藥基因在食物鏈中的傳遞加速了耐藥菌株的進化和傳播。公共衛(wèi)生觀念的提高，抗生素的規(guī)范使用，溶菌酶、抗菌肽、乳鐵蛋白、Nisin 等天然抗菌藥物的挖掘和應用緩解了抗生素使用的必要性。溶菌酶（lysozyme）最早被發(fā)現(xiàn)于人鼻涕黏液中，隨后在人的組織、分泌物，如乳汁、鼻涕、唾液、眼淚、血液中被檢測到，且溶菌酶類似物在其他動物、植物、海洋生物中被分離出［2］。溶菌酶具有肽聚糖水解酶活性，能夠特異性識別水解細胞壁肽聚糖層，是一種典型的陽離子、疏水的兩性蛋白，可利用靜電作用吸附至細菌細胞壁、用疏水作用打開磷脂雙分子膜層裂解細胞壁，因此缺乏酶活性的溶菌酶仍具有部分抗菌性。

人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）基因位于人體12q15 染色體，用于編碼人溶菌酶蛋白（EC 3.2.1.17），天然的hLYZ 含量少、收集難、成本高。雞蛋白溶菌酶（hen egg white lysozyme，HEWL）來源廣泛，鮮蛋白含量高、抗菌效果好，最早被作為食品、飼料添加劑。hLYZ的生物活性是HEWL的3倍［3］，熱穩(wěn)定性高，應用于人體不會產(chǎn)生過敏反應，hLYZ 在醫(yī)學治療、食品加工、飼料生產(chǎn)的前景較HEWL 好。研究發(fā)現(xiàn)，將溶菌酶阿拉伯樹膠聯(lián)合作為一種天然防腐劑和乳化劑，對蛋黃醬的保鮮效果很好［4］；重組hLYZ 對口腔疾病致病菌，如變形鏈球菌、白色念珠菌、牙齦卟啉單胞菌的體外抗菌實驗發(fā)現(xiàn)，重組hLYZ的抗菌效果優(yōu)于雞蛋清溶菌酶［5］。hLYZ 通過基因工程技術在細菌［6］、酵母［7-8］、水稻［9］、動物［10-12］中成功構建了生物反應器，用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。其中巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為真核微生物優(yōu)勢明顯，其生長周期短，具有獨特的真核蛋白合成途徑和蛋白翻譯修飾功能，包括二硫鍵的形成、糖基化的修飾［13］。同時P.pastoris的醇氧化物酶基因AOX1 啟動子可控制外源基因表達蛋白，通過添加甲醇誘導表達，較大腸桿菌表達添加的異丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）成本低，因此P.pastoris是生產(chǎn)重組蛋白、疫苗的優(yōu)良宿主。

在蛋白質合成翻譯時，物種不同、基因不同的氨基酸使用同義密碼子的頻率亦不同，具有這些偏好表達的密碼子稱為最優(yōu)密碼子［14］。根據(jù)表達宿主選擇目的基因最優(yōu)密碼子，能提高目的蛋白異源表達水平，獲得高效表達。張賽南［15］通過對雞蛋清溶菌酶密碼子的優(yōu)化重組，得到一株對G418 具有高抗性的畢赤酵母。

基于hLYZ的工業(yè)化生產(chǎn)需求，選擇畢赤酵母GS115 染色體，通過優(yōu)化hlyz的密碼子序列提高異源表達水平，獲得產(chǎn)量高、活性好的hLYZ。先利用基因工程技術，將優(yōu)化后的溶菌酶基因連接在pPIC9K上，然后導入畢赤酵母GS115 染色體，篩選出高效表達的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz（G-P-hlyz）。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸埃希菌TOP10、畢赤酵母GS115、溶壁微球菌（Micrococcus luteus，ATCC 4698）、pPIC9K 質粒均于?20 ℃保存。金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、側孢芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus，ATCC 4517）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，ATCC BAA-611）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 15442）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 11229）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，ATCC 13883）均在實驗室儲藏保存。鼠傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium，ATCC 14028）由杭州市公共衛(wèi)生中心提供。

1.1.2 試劑

Prime STAR Max DNA Polymerase，ClonExpressTMⅡ重組克隆試劑盒，限制性內切酶SanB Ⅰ、NotⅠ、SalⅠ，Ex Taq DNA Polymerase，PCR 微生物裂解緩沖液（購于寶日醫(yī)生物技術有限公司），蛋白非預染MarkerⅡ中分子質量范圍（由上海生工生物工程有限公司合成），人乳溶菌酶標準品≥100 000 U·mg?1（Sigma L1667），雞蛋清溶菌酶標準品≥40 000 U·mg?1（Sigma L6876），Sephadex-G50（Siama），LB 液體培養(yǎng)液，LB 固體培養(yǎng)基，YPD酵母培養(yǎng)基，G418 遺傳霉素，含甘油的BMGY 培養(yǎng)基，含甲醇的BMMY 培養(yǎng)基。

1.1.3 引物

特異性引物hlyz-F：5′-AGGCTGAAGCTT ACGTAATGAAGGTTTTCGAAAGAT-3′，SanBⅠ；

特異性引物hlyz-R：5′-TTAATTCGCGG CCGCTTAAACACCACAACCTTGAAC-3′，NotⅠ；

通用引物3′AOX：5′-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3′；

通用引物α-Factor：5′-TACTATTGCCAGC ATTGCTGC-3′。

1.2 方法

1.2.1hlyz基因密碼子優(yōu)化及重組載體構建

氨基酸由多種密碼子編碼，在不同基因、不同物種間，相同氨基酸的密碼子出現(xiàn)頻率不同，這與不同細胞中tRNA的濃度高低有關。為提高異源基因在宿主中的蛋白表達水平，需對基因密碼子進行優(yōu)化［14］。優(yōu)化策略包括替換稀有密碼子以降低翻譯錯誤，更換偏好密碼子以提高翻譯效率、提高密碼子適應指數(shù)（codon adaptation index，CAI），優(yōu)化GC 值以提高基因合成穩(wěn)定性等。因此，對從美國國家生物信息技術中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下載的hlyz基因根據(jù)畢赤酵母宿主特點進行密碼子優(yōu)化，并由上海生工生物工程公司化學合成連接至pUC57-hlyz質粒。如圖1 所示，以hlyz-F和hlyz-R 為引物、pUC57-hlyz為模板做PCR 擴增，擴增條件為98 ℃5 min，98 ℃5 s，58 ℃5 s，72 ℃10 s，重復30 次步驟2～步驟4，于4 ℃保溫。參照膠回收試劑盒說明書，對PCR 產(chǎn)物進行純化，回收hlyz基因片段。準備線性化質粒，將pPIC9K 質粒分別進行SanBⅠ、NotⅠ雙酶切，參照一步克隆試劑盒說明書，將hlyz基因重組連接至pPIC9K 質粒，將pPIC9K-hlyz轉化至E.coil-TOP10，在Kan 抗性平板上篩選。用牙簽挑出平板上的單克隆，做菌落PCR 鑒定并進行測序。

圖1 重組hLYZ 異源表達策略Fig.1 Construction and expression of human lysozyme

1.2.2 重組畢赤酵母的轉化構建

制備感受態(tài)畢赤酵母GS115，取OD600=1.3～1.5的GS115 菌液50 mL，離心棄上清，用50 mL 冰水重懸2次，棄上清加入20 mL 冰山梨醇，洗滌后離心，取250 μL 濃度為1 mol·L?1的冰山梨醇重懸，分裝成每管80 μL的感受態(tài)細胞。將SalⅠ酶切線性化pPIC9K-hlyz電轉化感受態(tài)畢赤酵母。將80 μL感受態(tài)細胞和10 ng 線性質?；旌?，加入電轉杯冰浴5 min，15 kV電擊4～6 s，立即加入1 mL 濃度為1 mol·L?1的冰山梨醇，30 ℃孵育2 h 后取100 μL 菌液涂抹于MD 平板，30 ℃培養(yǎng)2 d。進一步篩選遺傳霉素，將MD 平板上的菌落洗滌稀釋，涂抹于含6.0 mg·mL?1G418的YPD 平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。對生長的單菌落做PCR 擴增，挑取菌落并將其溶解于50 μL 裂解液，80 ℃加熱5 min，低速離心，取1～2 μL 上清為模板添加至20 μL的PCR 體系，擴增條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，重復30 次步驟2～步驟4，于4 ℃保溫。

1.2.3 瓶搖發(fā)酵表達和蛋白鑒定

根據(jù)畢赤酵母表達說明書，將G-P-hlyz單菌落接種于25 mL BMGY 培養(yǎng)基，在30 ℃，250 r·min?1條件下培養(yǎng)，當OD600=2時，4 500 r·min?1離心10 min，收集沉淀菌體，用250 mL 甲醇誘導BMMY 培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)搖瓶令其發(fā)酵表達。每間隔24 h 加入1%甲醇誘導，取2 mL 樣品用于后續(xù)分析鑒定，誘導144 h 后終止發(fā)酵，6 000 r·min?1離心收集上清。

考慮發(fā)酵液上清經(jīng)三氟乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）沉淀法除鹽處理后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的效果更好，取800 μL 上清加入100 μL 100%的TCA中，搖勻，?20 ℃處理12 h，離心棄上清，然后用冰丙酮除去TCA 殘留液，加PBS 重懸，取樣，再加入等體積2×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，制備好電泳樣品。將15%分離膠的聚丙烯酰胺凝膠組裝后上樣，每個泳道10 μL，先80 V 電泳30 min，再120 V 電泳100 min。隨后用考馬斯亮藍染色，用脫色液洗滌，拍照觀察。

按照Bradford 蛋白濃度檢測試劑盒上的操作說明，測定發(fā)酵液上清的總蛋白濃度，將100 μL 不同稀釋濃度的標準樣品加入1 mL Bradford 工作液，室溫反應5 min 后測定595 nm 處的吸光度（OD595）。上清樣品測定方法相同，代入標準曲線測得蛋白濃度。

1.2.4 重組hLYZ 酶活測定

hLYZ的活性檢測方法較成熟，常用的有比濁法，利用溶菌酶對溶壁微球菌的殺傷作用，根據(jù)紫外吸光度的變化情況測定酶活。先將hLYZ 標準品（100 000 U·mg?1）稀釋至50，100，150，200，250 U·mL?1，再用0.1 mol·L?1磷酸鹽緩沖液將溶壁微球菌稀釋至OD450=0.7±0.1，在室溫下，取2.8 mL底物檢測菌溶液，將其加至200 μL 稀釋樣品中，混合，記錄3 min 內OD450變化情況，將反應2 min 時的讀數(shù)記為A1，反應3 min 時的讀數(shù)記為A2，變化值ΔE=A1?A2，以酶活為縱坐標，ΔE為橫坐標作標準曲線。上清樣品實驗操作相同，記錄ΔE，注意樣品每分鐘內吸光度的下降值控制在0.03～0.08內，根據(jù)標準曲線計算酶活。

1.2.5 體外抗菌譜測定

為檢測表達的hLYZ 對不同致病細菌的抑制和殺滅能力，用溶菌酶標準品、發(fā)酵液樣品測定酶活，然后測定樣品的最低抑菌酶活，根據(jù)最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）實驗方法［16］修改。選擇8 種常見的致病菌（革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌各4 種）作為體外抑菌實驗的被檢測菌株，如表1 所示。首先，取8 支10 mL 玻璃試管，高溫滅菌后均加入2 mL LB 培養(yǎng)液，編號。然后，管1 加入2 mL 樣品，搖勻，管2 加入4 mL 樣品，搖勻，依次2倍稀釋至管7，管8 為空白對照，不加樣品。最后，加入菌液至濃度為0.5個麥氏比濁，搖勻后于37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。肉眼觀察試管溶液的渾濁度，管1 由澄清變渾濁，其樣品濃度為最低抑菌酶活。

表1 MIC 實驗指示菌株Table 1 Tested bacteria of MIC

1.2.6 Sephadex G50 分離純化

通過葡聚糖凝膠（Sephadex）G50 實現(xiàn)蛋白分離，同時達到脫鹽的效果。根據(jù)hLYZ的分子質量選擇Sephadex G50，將Sephadex G50 粉末加水溶脹24 h 后裝柱，用20 mmol·L?1的Tris-HCl，pH 8.0 平衡洗脫至基線，加入2 mL 發(fā)酵液上清，流速為0.4 mL·min?1，繼續(xù)用平衡緩沖液洗脫15 h。收集洗脫峰，真空冷凍干燥機濃縮凍干。

2 結果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化前后對比如圖2 所示，優(yōu)化后序列的GC值為43.43%，CAI 從0.095升至0.950，且可替換畢赤酵母偏好性密碼子，如用精氨酸（Arg）偏好密碼子AGA、亮氨酸（Leu）偏好密碼子TTG 替換。這些優(yōu)化策略提高了hlyz基因在畢赤酵母中的轉錄表達水平。

圖2 hlyz 基因密碼子優(yōu)化前后對比Fig.2 Alignment of hlyz sequence and optimized gene ori 為原始基因序列，opt 為優(yōu)化后基因序列。

2.2 pPIC9K-hlyz 載體構建結果

雙酶切線性化的pPIC9K和hlyz基因片段通過同源臂重組連接，及pPIC9K 質粒上的氨芐抗性基因賦予陽性菌落氨芐抗性，重組質粒pPIC9K-hlyz的構建結果如圖3 所示。由圖3知，菌落PCR 在396 bp 處的條帶與目的蛋白條帶一致，重組質粒測序峰圖正常，與目的序列一致，pPIC9K-hlyz構建完成。

圖3 重組質粒pPIC9K-hlyz的構建結果Fig.3 Construction results of pPIC9K-hlyz

2.3 G-P-hlyz的構建和鑒定

將重組質粒pPIC9K-hlyz電轉化為同源重組畢赤酵母染色體，經(jīng)過營養(yǎng)缺陷組氨酸的MD 平板、濃度梯度的遺傳霉素G418 篩選，對篩選菌落做PCR，鑒定結果如圖4 所示。特異性引物擴增條帶在396 bp 處與hlyz基因一致，通用引物擴增條帶在896 bp 處與hlyz基因和通用引物擴增基因之和一致。

圖4 重組畢赤酵母的菌落PCRFig.4 PCR product of Pichia pastoris

2.4 G-P-hlyz的發(fā)酵表達

畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型好氧菌。在搖瓶表達時，將250 mL BMMY 培養(yǎng)基置于1 L 錐形瓶中，間隔取樣，記錄其生長特點和蛋白酶活變化。SDS-PAGE結果（圖5）顯示，14.7 kDa 處的條帶與目的蛋白條帶一致。如圖6 所示，菌液的OD600與酶活變化曲線一致，兩者均隨誘導時間逐步上升，且在120 h 時達最高，菌液的酶活為（2 414.9±108.1）U·mL?1，蛋白濃度為166.7 μg·mL?1。

圖5 搖瓶發(fā)酵表達G-P-hlyz的SDS-PAGE 結果Fig.5 SDS-PAGE results of G-P-hlyz fermentation

圖6 發(fā)酵過程中菌體生長曲線及酶活變化Fig.6 Bacterial growth curve and lysozyme activity of supernatant

2.5 體外抗菌譜測定結果

以hLYZ 和HEWL 標準品為陽性對照，滅菌培養(yǎng)基為空白對照，分別對已知酶活的重組hLYZ 樣品、hLYZ 標準品、HEWL 標準品進行體外抗菌譜測定實驗，結果如表2 所示。3 種樣品對不同屬性致病菌的抗菌效果為革蘭氏陽性菌>革蘭氏陰性菌；對8 種致病菌的最低抑菌酶活為重組hLYZ 樣品

表2 對8 種細菌的最低抑菌酶活結果Table 2 Minimum antibacterial enzyme activity results

2.6 Sephadex G50 分離純化

發(fā)酵液中人溶菌酶蛋白與其他雜蛋白的分子質量差別較大。Sephadex G50 適合分子質量為5～15 kDa 物質的分離純化，結果如圖7 所示。通過分子篩選得到的分離效果較好，在第二個洗脫峰（泳道3）收集到大小一致的粗純品hLYZ。

圖7 Sephadex G50 純化的SDS-PAGE 結果Fig.7 SDS-PAGE results after Sephadex G50 purification

3 討論

溶菌酶的發(fā)現(xiàn)距今已有一個世紀，其來源廣泛，不易產(chǎn)生耐藥性，工業(yè)化生產(chǎn)效率高、成本低，溶菌酶的衍生產(chǎn)品已應用于食品、藥品、動物飼料等領域。現(xiàn)代生物表達技術在工業(yè)生產(chǎn)中具有較大優(yōu)勢，其中酵母真核表達系統(tǒng)具有周期短、構建表達成熟、分離純化簡單等優(yōu)點，尤其是真核蛋白經(jīng)蛋白翻譯后可進行修飾。畢赤酵母是分子生物學中最受歡迎的重組蛋白表達系統(tǒng)之一，其成功表達了多種干擾素、胰島素、人表皮生長因子、溶菌酶等，并作為商品大量生產(chǎn)出售。

對hlyz進行密碼子優(yōu)化，能在不改變蛋白序列、增強基因在畢赤酵母中適應性的情況下達到高效表達。優(yōu)化前，溶菌酶的酶活僅為812 U·mL?1，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，重組蛋白的酶活達（2 414.9±108.1）U·mL?1，提高了約3 倍。WEI等［17］構建的畢赤酵母重組hLYZ的酶活僅為533 U·mL?1，基因優(yōu)化后的酶活較其提高了4 倍；李學優(yōu)等［18］構建的SMD1168-pPIC9k-HLZ 菌株溶菌酶的酶活約1 901 U·mL?1，基因優(yōu)化后的酶活較其提高25%。比較已有的重組溶菌酶酶活發(fā)現(xiàn)，通過密碼子優(yōu)化，篩選了高效表達菌株，酶活表達得到了很大提高。

本研究獲得的重組hLYZ 酶活雖有較大提高，但仍較低，目前有研究通過增加基因拷貝數(shù)、串聯(lián)表達分子伴侶等方法進一步提高了異源表達水平，如HE等［19］構建了6個拷貝hlyz基因、共表達分子伴侶Ero1 或Pdi1，其酶活分別提高了1.5倍和2.3倍，最高達到（21 200±400）U·mL?1。另外，對發(fā)酵條件的響應面進行優(yōu)化亦可進一步提高畢赤酵母重組蛋白的高效表達，如YU等［7］利用Placket-Burman 設計和響應面分析（RSD）優(yōu)化畢赤酵母SMD1168 發(fā)酵條件（溫度、pH、接種量、體積、氧氣濃度），hLYZ酶活最終提高了2.2倍，達3 301 U·mL?1。畢赤酵母在發(fā)酵罐中的高密度培養(yǎng)能提高表達效率，在15 L 發(fā)酵罐中產(chǎn)物的酶活可達47 680 U·mL?1，提高了30 倍。本研究hLYZ的體外抑菌實驗結果顯示，hLYZ 對革蘭氏陽性菌的殺傷效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，hLYZ 在500 U·mL?1酶活下對大多數(shù)致病菌有很好的抑制作用，抗菌效果是hLYZ 標準品的10～20 倍。

4 結論

通過對hlyz基因進行密碼子優(yōu)化，成功構建了重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz，高效表達了hLYZ，抗菌效果好，對革蘭氏陽性菌殺傷力強，純化方法簡單，具有很好的工業(yè)生產(chǎn)前景。