汝沈圓，高靜東

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

附子，又名烏頭，拉丁文名AconitumcarmichaeliDebx.，是毛茛科烏頭屬植物的子根加工品，入藥已有一千多年歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》首次記錄了附子，并在書中將其歸為下品，是“大毒不可久服”的藥物[1]。附子性味辛、甘、大熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，主要功能有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛[2]。對(duì)于附子的研究目前主要集中在生物堿領(lǐng)域，但由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)報(bào)道了植物多糖的許多生物活性，附子多糖的研究也逐漸增加。在過去的十幾年里，人們發(fā)現(xiàn)附子多糖具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[3]，對(duì)附子多糖的關(guān)注越來(lái)越多。本文就近年來(lái)附子多糖國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 附子多糖的結(jié)構(gòu)和提取純化

1.1 結(jié)構(gòu)

多糖是指由糖苷鍵連接的10個(gè)或更多單糖形成的高分子聚合物，一般存在于動(dòng)物、植物及微生物細(xì)胞壁中[4]。然而，由于分子量大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖的研究一直是個(gè)難點(diǎn)。ZHAO等[5]發(fā)現(xiàn)附子多糖的結(jié)構(gòu)是α-(1/6)-d-葡聚糖，其平均分子量約為14 000 Da，且主鏈的每4個(gè)殘基C-3上都有1個(gè)葡萄糖。而YANG等[6]通過一系列理化和儀器分析發(fā)現(xiàn)，純化后的附子多糖由d-阿拉伯糖和d-葡萄糖組成，摩爾比為7.5∶92.5，平均分子量為6.29×106Da。這種結(jié)構(gòu)和分子量的差異是由于不同的提取方法所致[7]。

S.MORENO-MENDIETA等[8]通過回顧性研究，闡明了植物或微生物來(lái)源的多糖生物活性與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，它們結(jié)構(gòu)中的α/β-葡聚糖可以通過與特定受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮輔助活性，但是不同來(lái)源甚至相同來(lái)源分離出的葡萄糖聚合物都可能有所不同，生物活性也受到一定影響。

1.2 提取

附子多糖的提取目前主要有熱水浸提法、酶輔助法、微波提取法和超聲法。錢珍[9]和吳娜等[10]皆采用熱水浸提法，但吳娜在原有工藝的基礎(chǔ)上利用反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)進(jìn)行分析和建模，得出最佳提取條件為時(shí)間3.5 h，溫度90 ℃，料液比1∶20。朱盛林等[11]和張曉琳[12]分別在附子粉乙醇回流后采取微波輔助和植物復(fù)合酶輔助的方法提取多糖，張曉琳認(rèn)為當(dāng)溫度為45 ℃、pH=4.5時(shí)，用濃度為1.4%的植物復(fù)合酶提取1.5 h的結(jié)果最佳，為15.77%。而朱盛林等測(cè)得當(dāng)提取時(shí)間為10 min、溫度為80 ℃、料液比1∶20時(shí)附子多糖的提取率更高，達(dá)16.10%。魯靜等[13]將附子粉末加入80%的乙醇中回流，料液比10 mL/g時(shí)利用超聲在73 ℃的條件下提取34 min，最后得到的附子多糖平均提取率為19.05%(RSD=0.60%，n=3)，對(duì)比其他方法在提取時(shí)間和提取率上有一定優(yōu)勢(shì)。

1.3 純化

附子多糖的提取目前已有較多報(bào)道，但純化工藝卻研究甚少，方法也大不相同。較為常見的是醇沉法，吳娜等[10]將濃縮后的附子多糖提取液放入80%乙醇中沉淀，過濾后直接干燥得到粗多糖。朱盛林等[11]在醇沉的基礎(chǔ)上用無(wú)水乙醇、乙醚清洗沉淀，減少了有效成分在沉淀中的包裹損失。而丁興杰等[14]在醇沉、離心后用Sevage液去除多糖溶液中的蛋白質(zhì)，反復(fù)透析后得到精制多糖，純度達(dá)91.89%。

2 附子多糖的藥理作用

2.1 抗腫瘤

2.1.1 誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化 彭文珍等[15]將人早幼粒白細(xì)胞HL-60分別放入加有全反式維甲酸、生理鹽水和附子多糖的不同培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)附子多糖組的細(xì)胞核分化增多，部分早幼粒細(xì)胞分化為晚幼粒細(xì)胞，表明附子多糖對(duì)HL-60細(xì)胞有誘導(dǎo)分化的作用，且具有促進(jìn)HL-60細(xì)胞朝粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能，為臨床應(yīng)用附子治療人早幼粒白細(xì)胞病提供了依據(jù)，但具體機(jī)制不清。

2.1.2 促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡 有研究顯示，腹腔注射或灌胃給藥的附子粗多糖和酸性多糖可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而延長(zhǎng)H22和S180荷瘤小鼠的存活時(shí)間，發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。SUN等[17]發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞在附子多糖硫酸衍生物的作用下生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，并發(fā)生凋亡，其背后的原因可能與NF-κB/Bcl-2信號(hào)通路有關(guān)。而另有研究表明[18]，附子多糖培養(yǎng)48 h可以使H22細(xì)胞生存率顯著降低，細(xì)胞凋亡明顯增加。對(duì)比空白對(duì)照組，40 μg/mL的附子多糖大大減少了垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(PTTG1)的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，有效降低Akt的磷酸化水平，增加磷酸化P38絲裂素活化蛋白激酶(P-P38 MARK)的蛋白水平。荷瘤小鼠模型展現(xiàn)出相似的數(shù)據(jù)。在該研究中，PTTG1的表達(dá)抑制被證實(shí)與附子多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，與P13/Akt和P38 MAPK信號(hào)通路也有一定關(guān)系，而既往研究表明許多腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖都與P13K/Akt、P38 MAPK通路有關(guān)聯(lián)性[19-22]。因此我們可以推測(cè)，附子多糖可能通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)化基因1來(lái)增強(qiáng)P38 MAPK或減弱P13/Akt信號(hào)通路，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。

2.1.3 抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 MMP-2、MMP-14、TGF-β1是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志。安禎祥等[23]發(fā)現(xiàn)附子多糖作用后的胃癌移植瘤裸鼠瘤重顯著降低，胃癌血清TGF-β1含量下降，MMP-2、MMP-14蛋白表達(dá)下調(diào)，其中200 mg/(kg·d)灌胃的裸鼠MMP-2、MMP-14mRNA表達(dá)明顯下降，表明附子多糖可能通過下調(diào)MMP-2、MMP-14蛋白及其mRNA 的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到抑癌效果。ZHANG等[24]通過觀察人乳腺癌MDA-MB-435s細(xì)胞經(jīng)附子多糖及其硫酸衍生物作用后細(xì)胞遷移的程度，發(fā)現(xiàn)附子多糖(ACP1)及其硫酸衍生物(ACP1-s)可以顯著抑制MDA-MB-435s細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白骨架的聚合，降低Vav2的磷酸化，削弱Rac1的激活，而后兩者均為乳腺癌轉(zhuǎn)移有前景的治療靶點(diǎn)。其中，ACP1-s對(duì)MDA-MB435s細(xì)胞遷移的抑制作用強(qiáng)于ACP1，說(shuō)明硫酸化可增強(qiáng)天然多糖對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制能力，對(duì)附子多糖及其硫酸衍生物在抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用有指導(dǎo)意義。

2.2 促進(jìn)免疫應(yīng)答激活

2.2.1 誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞分化和成熟 樹突狀細(xì)胞被認(rèn)為是目前最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，且已被證實(shí)在抗腫瘤CD8+T細(xì)胞的初始交叉啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用，在效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和過繼T細(xì)胞治療中也是必需的[25]。因此長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直希望通過增加樹突狀細(xì)胞作為促進(jìn)T細(xì)胞效應(yīng)功能的手段，但接種疫苗或使用樹突狀細(xì)胞生長(zhǎng)因子等方法容易受到內(nèi)源性免疫抑制細(xì)胞的影響[26]。在此基礎(chǔ)上，有研究發(fā)現(xiàn)將外周血單個(gè)核細(xì)胞放入100 mg/L的附子多糖中培養(yǎng)，3 d后細(xì)胞出現(xiàn)分化，10 d后發(fā)展為典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)，CD80、CD83、CD86等共刺激分子表達(dá)均明顯提高。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，附子多糖誘導(dǎo)的樹突狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞最大直徑、表面積、樹突數(shù)目均無(wú)明顯差異，提示附子多糖可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的分化和成熟，從而活化T淋巴細(xì)胞、激發(fā)免疫應(yīng)答[27]，為中藥多糖作為免疫制劑參與抗腫瘤過程提供了可能性。

2.2.2 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖 淋巴細(xì)胞增殖在免疫反應(yīng)的激活級(jí)聯(lián)中非常重要[28]。ZHAO等[29]分別在體外和體內(nèi)測(cè)試了附子多糖作用下刀豆球蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明附子多糖可以劑量依賴性地促進(jìn)由特異性有絲分裂原誘導(dǎo)的小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，且當(dāng)附子多糖劑量在一定范圍內(nèi)時(shí)，可以通過刺激脾臟中分泌抗體的B細(xì)胞來(lái)促進(jìn)體內(nèi)的體液免疫。GAO等[29]選取不同品種的烏頭和藥用部位，分別從中提取多糖，得到以淀粉、非淀粉型α- d葡聚糖和果膠多糖為主要成分的多糖組分。通過給藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)多糖處理的小鼠淋巴細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞被激活，與模型組相比，多糖組的細(xì)胞毒性明顯提高。其中，果膠多糖比中性多糖展現(xiàn)出更顯著的抗腫瘤和免疫刺激活性。

2.2.3 促進(jìn)細(xì)胞因子釋放 有研究表明，附子多糖連續(xù)灌胃能使H22荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)恢復(fù)正常，提升白細(xì)胞水平[30]。與此同時(shí)，給予附子多糖的荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平(IL-2、TNF-α和IFN-γ)顯著提升，且呈現(xiàn)劑量依賴性，提示附子多糖可能通過促進(jìn)血清細(xì)胞因子的分泌來(lái)激活宿主機(jī)體的免疫反應(yīng)，間接發(fā)揮抗腫瘤活性。

2.3 其他作用

2.3.1 抑制血管鈣化 氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)是導(dǎo)致血管鈣化的主要原因之一，陳燕婷等[31]用該種方法制作了人體血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型，用不同濃度的附子多糖處理并觀察細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示，附子多糖可以使堿性磷酸酶(ALP)的活性降低，骨相關(guān)蛋白Osterix、Msx2、BMP2的mRNA表達(dá)下調(diào)，收縮蛋白SMA的mRNA表達(dá)提高，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化及細(xì)胞凋亡有抑制作用。其機(jī)制可能是通過降低神經(jīng)酰胺水平和其代謝酶中性鞘磷脂酶(N-SMase)的活性，調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺信號(hào)，從而達(dá)到抑制血管鈣化的效果。

2.3.2 改善胰島素抵抗 研究發(fā)現(xiàn)附子多糖可以增加3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗，對(duì)3H-葡萄糖在胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中的攝取也有促進(jìn)作用,同時(shí)經(jīng)過附子多糖培養(yǎng)后，胰島素抵抗脂肪細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4的轉(zhuǎn)位量顯著提高，但蛋白表達(dá)沒有明顯變化[32-34]。因此推測(cè)附子多糖可能是通過促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位，從而增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞3H-葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗，但具體機(jī)制尚不清楚。另有研究指出，在胰島素抵抗的發(fā)展過程中，炎癥是一個(gè)重要因素，而由肥胖誘導(dǎo)的組織炎癥被認(rèn)為是胰島素敏感性降低的主要原因[35]。SU等[36]用附子多糖治療高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠，4周后小鼠空腹血糖顯著降低，胰島素敏感性增加，葡萄糖耐量得到改善，DIO小鼠脂肪組織和肝臟以及血清中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)明顯下降，肥胖小鼠全身炎癥反應(yīng)有所緩解。提示附子多糖可以作為治療2型糖尿病靶向炎癥的潛在藥物，其機(jī)制可能與抑制核因子κB通路的激活，降低IRS-1的絲氨酸磷酸化和恢復(fù)PI3K/AKT途徑對(duì)葡萄糖的利用等有關(guān)。

2.3.3 促進(jìn)神經(jīng)元再生和抗抑郁 附子多糖可以增加成年小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生并產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)。YAN等[37]實(shí)驗(yàn)研究表明，對(duì)雄性大鼠注射100 mg/kg的附子多糖連續(xù)14 d后，附子多糖不僅逆轉(zhuǎn)了由長(zhǎng)期社會(huì)失敗壓力引起的回避行為，使社交失敗應(yīng)激動(dòng)物相互作用的時(shí)間增加，還逆轉(zhuǎn)了海馬神經(jīng)發(fā)生的抑制，促進(jìn)神經(jīng)元的再生。另外，在注射BDNF-TrkB信號(hào)通路的trkB抑制劑后，附子多糖給藥誘導(dǎo)的抗抑郁效應(yīng)和細(xì)胞增殖被完全阻斷，表明附子多糖的抗抑郁作用與神經(jīng)源性效應(yīng)和BDNF通路相關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

附子的有效成分主要是二萜生物堿和附子多糖。二萜生物堿已被證實(shí)有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效[38]，但同時(shí)也可引發(fā)心臟和神經(jīng)中毒等不良反應(yīng)[39]。與之相比，附子多糖在具有眾多生物活性的同時(shí)，幾乎沒有不良反應(yīng)[40]，因此值得進(jìn)一步研究。從上述報(bào)道可以看出，附子多糖抗腫瘤的途徑主要分為兩種，一種是對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用，通過誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡和抑制浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等方式阻止癌細(xì)胞的發(fā)展；另一種是間接途徑，通過刺激機(jī)體免疫力，增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)來(lái)更好地發(fā)揮抗腫瘤效果。但在具體的案例中，附子多糖是通過哪一種途徑抗腫瘤，或兩種途徑同時(shí)發(fā)揮作用尚不清楚，有待進(jìn)一步探究。此外，有研究顯示，多糖對(duì)腫瘤微環(huán)境的免疫治療有積極作用，在增加NK、CTL細(xì)胞免疫毒性、激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞因子釋放、降低免疫檢查點(diǎn)表達(dá)等多個(gè)方面療效顯著[41]。附子多糖具有良好的刺激免疫應(yīng)答作用，關(guān)于附子多糖與免疫治療的關(guān)系是一個(gè)值得研究的方向。而由于多糖本身分子量大的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其生物利用度普遍較低。研究顯示，某些多糖可以依靠不被吸收入體內(nèi)，通過直接影響腸道菌群來(lái)抑制宿主腫瘤[42]。腸道微生物群與宿主具有共生關(guān)系，在宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫和代謝中起決定性作用，并可調(diào)節(jié)癌癥治療效果。這也可以解釋為什么植物多糖不能很好地被吸收，但可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在今后附子多糖抗癌機(jī)制的研究中，對(duì)腸道微生物菌群的影響可以作為一個(gè)重要研究方向。另外，現(xiàn)在雖有許多報(bào)道證實(shí)了附子多糖的抗腫瘤作用，但對(duì)其抑瘤的有效劑量區(qū)間卻鮮有討論，對(duì)附子多糖起效的最大、最小劑量，最佳劑量區(qū)間仍不清楚。同時(shí)，從以上研究可以發(fā)現(xiàn)，附子多糖的純化目前主要停留在粗多糖階段，雖有一些除蛋白和層析方式的報(bào)道，但由于步驟繁瑣、效率低下等原因，多數(shù)學(xué)者仍選擇最簡(jiǎn)單方便的醇沉法。但隨著對(duì)附子多糖功效的逐步探索，多糖制品的開發(fā)是必然趨勢(shì)，屆時(shí)純化技術(shù)或面臨新的挑戰(zhàn)。

近幾十年來(lái)，中草藥多糖因其具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等重要生物活性而備受關(guān)注[43]，附子多糖也不例外，但相比黃芪、當(dāng)歸、甘草等多糖成分，附子多糖的研究仍比較欠缺。為了進(jìn)一步闡明附子多糖的藥理作用及其作用機(jī)制，研究者們還需加強(qiáng)附子多糖的提取純化、構(gòu)效關(guān)系、作用途徑、毒副作用等方面的研究，從而更加明確附子多糖對(duì)臨床疾病的治療意義，為附子多糖制劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。