張冬梅, 張 娜，紀晨旭, 趙海云, 張丹丹, 劉文坤

（1.山東省食品藥品檢驗研究院國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東濟南 250101；2.山東羽時生物科技有限公司，山東濟南 250014；3.濟南康橋醫(yī)藥科技有限公司，山東濟南 250100）

隨著醫(yī)療技術的進步和發(fā)展，關于生物醫(yī)療高分子材料的研究受到研究人員的廣泛關注[1]。理想的生物醫(yī)用材料應當具備良好的生物相容性、降解無毒以及易加工成型等性能。這其中，生物可降解聚氨酯在組織支架、外科手術、藥物釋放載體等生物醫(yī)療領域表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢[2-5]。此外，聚氨酯的力學性能優(yōu)異且易于改性，在其分子結構中引入特殊的功能基團可賦予其額外的物理化學性質[6,7]。

作為藥物載體，傳統(tǒng)的醫(yī)用材料多為將藥物包裹于材料內部，由于藥物與材料之間的作用力有限，這類載藥體系往往缺乏靶向作用，在正常生理環(huán)境中易出現(xiàn)治療藥物不可控擴散，導致漏釋或早釋現(xiàn)象，從而引發(fā)中毒等不良后果[8]。為了解決這一問題，環(huán)境響應型醫(yī)用材料逐漸受到人們的重視。常見的環(huán)境響應材料主要包括有因pH[9]、溫度[10]、磁場[11]和光照[12]等條件的變化而引起自身物理化學性質變化的材料。因此，可通過將特定響應基團引入到醫(yī)療材料的分子結構中來制備環(huán)境響應型生物醫(yī)用材料。眾所周知，人體各組織部位的生理pH 值存在顯著差異，特別是腫瘤細胞（pH=4～6）要明顯低于正常細胞（pH=7.4），因此，可通過pH 響應材料負載治療藥物以實現(xiàn)對病變部位的靶向釋放[13-15]，因此pH 響應材料的設計和制備就成為該領域的研究熱點。

本文設計和制備了一種具有pH 響應的可降解聚氨酯材料。首先合成了含吡啶的二醇化合物(PyDH)，然后通過簡單的縮聚方法將其引入到聚氨酯中，制備了側鏈含吡啶基團的聚(醚酯-氨酯)（PEEU-Py）。對PyDH 和PEEU-Py 的化學結構和理化性能進行了表征和研究。針對其在靶向給藥方面的潛在應用，詳細研究了PEEU-Py 膜材料的pH敏感溶脹性能和藥物釋放行為與介質pH 值的關系。并且對材料的細胞毒性進行了測試，進一步對材料作為藥物緩釋材料做出生物學評價。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

聚 乙 二 醇(PEG，Mn=2000)、ε-己 內 酯(ε-CL，99%): Sigma-Aldrich 試劑，使用前均80 ℃真空除水2 h；二月桂酸二丁基錫(DBTDL，95%)、二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI，98%)、4-乙烯基吡啶(VP，96%)、3-巰基-1,2 丙二醇(TG，97%):阿拉丁試劑有限公司；N,N-二異丙基乙胺(DIPA，99%): 百靈威科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，天津科密歐試劑有限公司，使用前加CaH2回流后重蒸。

1.2 PEEU-Py 膜的制備

1.2.1 PyDH 的制備：通過巰基與烯烴的點擊化學反應制備了PyDH，如Fig.1(a)所示，將VP (5.26 g,0.05 mol)和TG (5.41 g,0.05 mol)溶于10 mL DMF，加入反應瓶中攪拌均勻，再加入DIPA (0.13 g，1.0 mmol)，干燥氬氣保護下室溫反應5 h。經大量冰乙醚沉降，重復3 次后通過旋轉蒸發(fā)儀除去乙醚，得淡黃色黏稠液體，產率為94.2%。

1.2.2 聚酯醚PECL 的制備：如Fig.1(b)所示，取除水后的PEG (20 g, 0.010 mol)和ε-CL (20 g, 0.175 mol)于三口瓶中，加入質量分數(shù)0.3%的DBTDL 催化劑，在氬氣保護下，升溫至140 ℃反應20 h。反應后將產物溶于少量氯仿，經6～8 倍冰乙醚沉降、抽濾，此過程重復3 次，常溫真空干燥至恒量得到PECL，產率為92.6%。GPC (THF)：Mn=3940,MWD=1.12。

1.2.3 聚氨酯PEEU-Py 的制備：反應方程式如Fig.1(c)所示，投料比例按照Tab.1 進行。將一定量的PECL 和PyDH 溶于5 mL DMF 溶液后加入到裝有機械攪拌裝置的三口瓶中，再加入MDI 的DMF 溶液(0.25 g/mL)和0.03g 催化劑DBTDL，攪拌均勻后，在氬氣保護下，80 ℃油浴反應，至紅外檢測—NCO 吸收峰(2250～2280 cm-1)完全消失。反應過程中若體系變黏，加少量DMF 稀釋，約3 h。反應結束后用DMF 稀釋至0.25 g/mL，經8 倍冰乙醚沉降，抽濾，常溫下真空干燥至恒量得到聚氨酯PEEU-Py。根據(jù)PECL 與PyDH 的摩爾比將產物分別命名為PEEUPy-1/2，PEEU-Py-1/4，PEEU-Py-1/6 和PEEU-Py-1/8。

1.2.4 PEEU-Py 膜材料的制備：將PEEU-Py 用氯仿溶解，得到質量濃度為4.0 g/mL 的溶液，減壓除去溶液中的氣體，離心后將上清液緩慢注入聚四氟乙烯磨具中，常溫自然揮發(fā)4 d 后轉移至40 ℃真空干燥箱繼續(xù)干燥3 d，得到透明狀的淡黃色膜材料，厚度為(0.35±0.02) mm。

Fig. 1 Synthetic pathway of (a) PyDH, (b) PECL and (c) PEEU-Py

Tab.1 Compositions and molecular weight of the PEEU-Py samples

1.3 測試與表征

1.3.1 化學結構表征：1H-NMR 采用德國Bruker 公司的AVANCE II 型核磁共振波譜儀(400 MHz)，以氘代氯仿為溶劑；IR 采用德國Bruker 公司的Alpha 型傅里葉變換紅外光譜儀，掃描范圍400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1；滲透凝膠色譜(GPC)使用美國Waters公司的2414 型凝膠滲透色譜儀，流動相為四氫呋喃，流速1.0 mL/min，校準物質為單分散聚苯乙烯。

1.3.2 熱性能分析：膜的熱穩(wěn)定性使用美國Universal 公司的2050 型熱重分析儀(TGA) 測定，氮氣保護下以20 ℃/min 的升溫速率從室溫加熱到600 ℃；熱轉變使用美國TA 公司的2910 型差示掃描量熱儀(DSC)，以液氮為冷卻劑，以10 ℃/min 的升溫速率從-40 ℃加熱到180 ℃對材料的熔融行為進行測試。

1.3.3 結晶結構分析：通過德國布魯克公司D8 AVANCE 型X 射線粉末衍射儀（XRD）表征材料的結晶性。將膜材料裁剪為1 cm×1 cm 正方形置于樣品臺，設定電壓和電流分別為40 kV 和20 mA，以15(°)/min 的速度在2θ為5°～55°范圍內進行掃描。

1.3.4 親水性和溶脹率測試：材料表面的親水性通過其表面與水形成的接觸角進行測定，將膜材料裁剪為1 cm×1 cm 大小，使用芬蘭KSV 公司的CAM200 型水接觸角測試儀進行測試，每個樣品測定3 次，取平均值。溶脹率采用平衡吸水率的方法測定，將完全干燥的膜材料（1 cm×1 cm，質量記為mo）浸入PBS 溶液中(pH=1.5，7.0，11.5)，每隔一段時間用濾紙擦除表面水漬后稱量，直至質量不再增加，即達到平衡溶脹，質量記為mp，每個樣品平行測量3 次。平衡吸水率（WU）通過式(1)計算:

1.3.5 力學性能測試：根據(jù)國際標準ISO 527-2-2012，將材料裁剪為標準啞鈴狀，在單柱拉力機(HY939C 型，恒宇)上進行拉伸測試，拉伸速率為50 mm/min。

1.3.6 體外模擬降解分析：通過質量損失法測定膜材料的水解降解性。將干燥的1cm×1 cm 大小的膜材料稱量后記為m0，浸入模擬體液(SBF)，密封后置于(37±0.5)℃的生物培養(yǎng)箱中，每隔一段時間后將膜材料取出，干燥后稱質量為mn(n=1,2,3,…)，直至膜材料完全破碎無法稱量。每個樣品平行3 次。通過式(2)計算降解失重率（W）

1.3.7 藥物緩釋分析：將4.0 g 膜材料和40 mg 頭孢西酮溶于150 mL DMF 中,通過溶劑揮發(fā)法制備載藥膜材料。取3 份一定質量的膜材料，分別浸入PBS溶液(pH=1.5，7.0，11.5) 中，密封置入(37±0.5)℃的生物培養(yǎng)箱中，每隔2 h 后取1 mL 的PBS 溶液，稀釋至一定濃度后用紫外分光光度計測定204 nm 的吸光度，根據(jù)標準曲線計算藥物釋放量。頭孢西酮在不同pH 值的PBS 溶液的標準曲線如下：

1.3.8 細胞毒性分析：以小鼠L929 成纖維細胞為實驗細胞，通過MTT 法[16,17]測定膜浸出液的細胞毒性。先用乙醇清洗材料表面，紫外滅菌20 min 后用3 mL DMEM (添加10%牛胎血清)中提取浸出液，將浸出液按體積比1:1 稀釋后取0.1 mL 加入培養(yǎng)板中，以5×104mL-1的密度接種L929 細胞?？瞻讓φ諡樾迈r培養(yǎng)液中的L929 細胞。將細胞在37 ℃，5%CO2條件下進行培養(yǎng)72 h，用0.5 mg/mL 噻唑藍(MTT)測定細胞毒性。使用酶標儀測定570 nm 處的吸光度，與對照組參照，計算細胞存活率。

Fig.21H-NMR spectra for (a) MDI, (b) PyDH, (c) PECL and (d)PEEU-Py-1/8

2 結果與討論

2.1 核磁共振分析

MDI，PyDH，PECL 和PEEU-Py-1/8 的1H-NMR 見Fig.2 (PEEU-Py-1/2～1/8 的譜圖基本一樣，這里以PEEU-Py-1/8 為 例)。 在PyDH 的1H-NMR 譜 圖(Fig.2b)中，δ7.28～8.48，δ4.64～4.82，δ3.61 和δ2.53～3.36 分別為吡啶環(huán)、羥基、次甲基和亞甲基上的質子峰，并且沒有出現(xiàn)烯鍵(δ6.75)和巰基(δ2.07)的質子峰，說明雙鍵與巰基完全反應。在PECL 的1H-NMR譜圖(Fig.2c)中，δ4.06，δ2.29 和δ3.64 處的峰可歸于PCL 和PEG 鏈段中的亞甲基質子峰。根據(jù)峰面積之比，說明開環(huán)反應完全，不存在殘留的單體ε-CL。而在PEEU-Py-1/8 的1H-NMR 譜圖(Fig.2d)中，羥基峰消失，說明羥基與—NCO 完全反應，同時還保留了苯環(huán)、吡啶環(huán)和PECL 中亞甲基的質子峰。從以上分析可以確定PEEU-Py 的成功合成，其化學結構符合預期。

Fig. 3 IR spectra of (a) MDI, (b) PyDH, (c) PECL and (d) PEEUPy-1/8

2.2 紅外光譜分析

Fig.3 為MDI，PyDH，PECL 和PEEU-Py-1/8 的IR譜圖（PEEU-Py-1/2～1/8 的譜圖基本一樣，這里以PEEU-Py-1/8 為例）。在PyDH 的IR 譜圖(Fig.3b)中，1618 cm-1和1422 cm-1處的吸收峰分別為吡啶環(huán)中的C=N 和C=C 的吸收峰，說明PyDH 含有吡啶環(huán)結構，同時沒有出現(xiàn)S—H 的吸收峰，說明不存在未反應的 巰 基。在PECL 的IR 譜 圖(Fig.3c)中，1092 cm-1，1723 cm-1和3510 cm-1處的吸收峰分別為醚鍵C—O—C、酯基中的C=O 和末端羥基的—OH 的吸收峰，不存在環(huán)酯基中的C=O 吸收峰(1760 cm-1)，說明ε-CL 發(fā)生了開環(huán)反應，產物中無單體殘留。將PEEU-Py-1/8 (Fig.3d) 與MDI(Fig.3a) 的IR 譜 圖 相比，—NCO 的吸收峰(2270 cm-1)完全消失，新生成了氨基甲酸酯的吸收峰(3325 cm-1和1732 cm-1)，同時還保留了PyDH 和PECL 各部分結構的吸收峰，進一步確定聚氨酯的合成。

2.3 熱轉變分析

PEEU-Py 膜的DSC 曲線及相應的特征值分別見Fig.4 和Tab.2。從曲線中可以發(fā)現(xiàn)，所有膜材料只出現(xiàn)1 個玻璃化轉變溫度(Tg)，說明軟硬段的微相分離程度較低。這一方面是由于氨基甲酸酯中的—NH—與C=O 之間形成了分子間氫鍵，限制了分子鏈段的運動能力；另一方面，柔性的PEG 鏈段起到增塑的作用，降低了軟硬段之間的極性差異。另外，還可以發(fā)現(xiàn)所有DSC 曲線存在1 個較寬的熔融吸熱峰(Tm)，這表明PEEU-Py 具有一定的結晶性，但吸熱峰的焓變較小，說明結晶性較低。從Tab.2 中可以發(fā)現(xiàn)，隨著PyDH 含量的增加，PEEU-Py 的Tg從28.7 ℃逐 漸 增 加 至28.3 ℃、Tm從85 ℃增 加 至104 ℃，然而各吸熱峰的焓變值（ΔHf）卻從12.6 J/g降低至3.4 J/g。這歸因于PyDH 中含有剛性的吡啶環(huán)結構，PyDH 含量增加，形成的氫鍵也越多，限制了鏈的運動，從而降低了材料的微相分離結構，導致低的結晶能力。

Fig.4 DSC curves of PEEU-Py films

2.4 結晶性分析

Fig.5 為PEEU-Py 膜材料的XRD 曲線。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，所有膜材料在2θ=21.5°均出現(xiàn)1 個寬而散的衍射峰，表現(xiàn)出典型的低結晶聚合物的特征。隨著PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，衍射峰的強度逐漸降低，應為硬段含量的增加導致了分子鏈之間的氫鍵增加，限制了分子鏈的有序排列。XRD 結果與DSC 曲線分析相一致。

Tab.2 Thermal transformation properties of PEEU-Py films

Fig.5 XRD patterns of PEEU-Py films

2.5 表面親水性和溶脹率

通過測定膜表面水接觸角來評價PEEU-Py 表面的親水性，結果如Fig.6 所示。從圖中可以看出，PEEU-Py 膜材料表面呈現(xiàn)一定的親水性，但親水性較低。隨著PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，水接觸角從72.3°逐漸降低至57.8°, 膜表面親水性逐漸增強。這是因為材料表面的親水性與其表面的親水組分相關，在PEEU-Py 中含有2 種親水組分，分別是PEG 鏈段和吡啶基團。隨著PyDH 的增加，PEG含量相對降低，但吡啶環(huán)的增幅要大于PEG 鏈段的降幅，同時，吡啶基團位于側鏈，其N 原子更容易與水形成氫鍵，形成富集在材料表面的親水層，所以整體表現(xiàn)為親水性逐漸增強的趨勢。

Fig. 6 Surface water contact angle of PEEU-Py films

材料溶脹性通過其平衡吸水率來測定，F(xiàn)ig.7 為PEEU-Py 膜材料在不同pH 值介質中(pH=1.5，pH=7.4和pH=11.5)的平衡吸水率。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，所有PEEU-Py 膜材料在3 種pH 環(huán)境下都表現(xiàn)出相似的溶脹行為, 其平衡吸水率為：酸性介質＞中性介質＞＞堿性介質。在pH=1.5 的介質中，膜的平衡吸水率分別為pH=7.0 和pH=11.5 的2 倍和8 倍以上。隨著PyDH 質量分數(shù)從8.24% 增加到21.19%(Tab.1)，平衡吸水率在酸性介質中逐漸增大，而在中性介質基本不變，堿性介質中反而略微下降。這與吡啶基團的pKb=8.75 相一致，該溶脹行為表明PEEU-Py 膜隨著外界酸堿條件的改變表現(xiàn)出優(yōu)異的pH 敏感性。這是因為在酸性條件下，吡啶環(huán)上的N原子容易與H+質子化形成NH+，不僅親水性更強，而且破壞了吡啶環(huán)與氨基甲酸酯基團之間的氫鍵，同時帶電基團之間靜電斥力也導致網絡空間的增大，更易水分子進入材料內部；在堿性(或中性)條件下，吡啶環(huán)與氨基甲酸酯之間還可以形成額外的氫鍵，從而使網絡結構更加致密可進一步阻礙水分子的進入，導致低的平衡吸水率。PEEU-Py 靈敏的pH 敏感性，還因為位于側鏈的吡啶基團具有更高的自由度，更易與介質中的H+發(fā)生作用?？偟膩碚f，PEEU-Py 有優(yōu)異的pH 響應性，有望用作智能控制藥物釋放載體的可逆開關。

Fig. 7 Equilibrium water absorption of PEEU-Py films

Fig. 8 Stress-strain curves of PEEU-Py films

2.6 力學性能

材料的力學性能與其組成及分子鏈排布密切相關，這對應用于醫(yī)學領域的生物材料具有重要的意義。Fig.8 為PEEU-Py 膜在室溫下的應力-應變曲線，從曲線中得到的特征值見Tab.3。所有PEEU-Py樣品都呈現(xiàn)出一個平滑的屈服點，這表示材料從彈性到塑性的轉變。隨著PyDH 含量的增加(PEEUPy-1/2～-1/8)，斷裂強度和彈性模量逐漸增加，分別從1.8 MPa 和0.9 MPa 增 加 至12.1 MPa 和9.6 MPa；斷裂伸長率依次降低，從1667%降低至502%。這主要歸因于硬段含量的增加，與文獻報道的規(guī)律一致[18]。總體而言，PEEU-Py 膜具有優(yōu)異的拉伸性能，可以滿足其作為醫(yī)療衛(wèi)生材料對力學性能的要求。

2.7 體外模擬降解

生物可降解是作為藥物載體高分子材料的必要前提，通過檢測材料在SBF 中的質量損失來研究PEEU-Py 的降解性，失重曲線如Fig.9 所示。可以看出，PEEU-Py-1/2 降解速率最快，在第9 周后已完全破碎無法稱量，失重率達到50.4%。隨著PyDH 含量的增加(PEEU-Py-1/2～1/8)，其降解失重率依次降低。PEEU-Py 的降解主要是酯鍵的水解降解，所以降解速率主要受酯鍵含量和與水接觸程度的影響。隨著PyDH 含量的增加，一方面材料中酯鍵的相對含量逐漸降低；另一方面，硬段含量的增加會使分子鏈間形成更多的氫鍵，從而導致更緊密的三維結構，抑制了水與酯鍵的接觸，降解速率降低。

Fig. 9 Mass loss curves of PEEU-Py films against degradation time in PBS (pH=7.4)

2.8 藥物緩釋

Fig.10 和Fig.11 分別為PEEU-Py-1/8 膜材料的藥物釋放曲線(其他膜材料藥物釋放趨勢與之相同)和不同PyDH 含量的PEEU-Py 膜在不同pH 值介質下的最大藥物釋放量。從Fig.10 可以發(fā)現(xiàn)，PEEU-Py-1/8 膜材料在不同pH 值的藥物釋放速率和藥物釋放量存在明顯差異：在pH=1.5 環(huán)境下藥物釋放速率最快，在24 h 后藥物釋放量能夠達到81.5%；在pH=11.5 環(huán)境下藥物釋放速率最慢，24 h 后的藥物釋放量不足15%。這說明以PEEU-Py-1/8 材料為載體的藥物釋放具有靈敏的pH 響應性，pH 值越低，藥物釋放量越高，藥物釋放速率越快。此外，在pH=1.5 和pH=7.0 環(huán)境下，最大藥物釋放量隨著PyDH 含量的增加而增加(Fig.11)，而在pH=11.5 環(huán)境下恰恰相反。這一趨勢與前面的溶脹率(或吸水率)結果相一致：高溶脹度形成的松散結構加速了藥物的擴散。而堿性條件下最大藥物釋放量降低，還可歸因于頭孢唑酮與聚合物鏈段形成的氫鍵抑制了藥物的擴散。以上結果表明，PEEU-Py 材料在作為由體內pH值觸發(fā)開關的藥物緩釋載體方面有較高的潛在應用前景。

Fig. 10 Drug release curves from the PEEU-Py-1/8 film under different pH conditions

2.9 細胞毒性

細胞毒性測試是評價材料生物相容性的重要指標之一，通過MTT 法檢測PEEU-Py 材料提取物對L929 細胞的細胞毒性，結果如Fig.12 所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，細胞存活率稍稍微降低，但培養(yǎng)72 h 后，所有樣品的細胞存活率仍然在75%以上。按照GB/T 16886.20-2015 標準，為Ⅰ類細胞毒性，說明該材料具有對良好的細胞相容性，滿足體內材料的要求。另外，所有的膜材料提取物相同培育時間下細胞活性無明顯差異，說明PyDH 含量對細胞毒性的影響較小。細胞毒性結果表明該材料無明顯細胞毒性，可以滿足其作為生物醫(yī)療材料對細胞毒性的要求。

Fig.12 Cell viability in the PEEU-Py films extracts by MTT

3 結論

本文設計和制備了一種pH 響應型可降解聚氨酯(PEEU-Py)材料，并對其化學結構和理化性能進行了表征和研究。結果表明該材料不僅具有水解降解性，并且具有優(yōu)異的pH 響應性，在pH=1.5 的條件下，膜材料的平衡溶脹率分別是pH=7.0 和pH=12.0條件下的2 倍和8 倍以上；藥物緩釋效率主要受溶脹性能的影響，隨著介質pH 值的降低，藥物釋放效率提高。此外，通過對膜材料提取物的細胞毒性測驗，細胞存活率超過75%，表明該材料具有良好的細胞相容性，可作為體內材料使用?？傊遬H 響應型的可降解PEEU-Py 材料具有作為生物開關的應用潛力，可以通過外部pH 環(huán)境變化進行藥物的靶向釋放，在智能藥物輸送裝置方面有較高的應用前景。