楊艷娟，胡 琳，李潔瀅，田 正，周 忠，焦 蓉

川崎病(kawasaki disease, KD)是一種以全身性血管炎為特征的兒童發(fā)熱性疾病，5歲以下兒童多見。冠狀動脈病變?yōu)槠鋰乐夭l(fā)癥，經(jīng)靜脈注射免疫球蛋白治療后仍有25%的患兒發(fā)生冠狀動脈病變。KD發(fā)病機制尚不清楚，但臨床普遍認為，氧化應激和炎癥導致的內(nèi)皮功能障礙可能參與了KD的起始和發(fā)展[1]。紅系衍生核因子相關因子2(Nrf2)是一種調(diào)節(jié)抗氧化基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，能結合抗氧化反應元件(ARE)控制細胞保護基因的表達，如血紅素氧化酶-1(HO-1)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童比較，KD急性期患兒外周血Nrf2及HO-1水平顯著降低，靜脈注射免疫球蛋白治療后升高，這說明KD血管內(nèi)皮損傷可能受Nrf2/HO-1信號通路的調(diào)控[3]。芍藥苷(PF)是芍藥的主要有效成分，不僅具有多種生物學效應，且不良反應較小。已有研究發(fā)現(xiàn)，PF可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制脂多糖刺激的人Caco-2細胞炎癥反應、抵抗H2O2誘導的黑素細胞氧化應激等[4-5]。但PF能否預防或治療KD血管內(nèi)皮損傷少見報道。本研究擬采用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)處理人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAECs)建立KD細胞損傷模型[6-7]，觀察PF對KD血管內(nèi)皮細胞是否具有保護作用，并進一步探討其機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 HCAECs細胞株購自深圳Otwo Biotech公司；PF(純度>98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；活性氧(ROS)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、β-actin一抗、Nrf2一抗、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)一抗、兔二抗、鼠二抗購自Proteintech公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、HO-1、白細胞介素-6(IL-6)一抗購自ABclonal公司；磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)、Keap1一抗購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與藥物制備：HCAECs細胞接種于含10%牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長密度進行換液和傳代培養(yǎng)。PF用DMSO稀釋至100 mg/ml并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其終濃度為25 μg/ml。TNF-α用蒸餾水稀釋至25 μg/ml并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其終濃度為50 ng/ml。

1.2.2實驗分組與給藥：HCAECs細胞隨機分為Control組、PF組、KD組、PF+KD組。各組細胞均給予含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，Control組不給予任何處理，PF組和PF+KD組給予濃度為25 μg/ml的PF預處理24 h，隨后KD組和PF+KD組給予濃度為50 ng/ml的TNF-α處理6 h。

1.2.3CCK-8法檢測HCAECs細胞增殖：取對數(shù)生長期的HCAECs細胞接種于96孔培養(yǎng)板(4000個/孔)，置于細胞培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁生長良好，分別以不同濃度PF(0、12.5、25、50、100、200 μg/ml)處理HCAECs細胞24 h，或不同濃度TNF-α(0、12.5、25、50 ng/ml)處理HCAECs細胞6 h，結束后每孔加入10 μl CCK-8試劑，避光孵育2.5 h，取出后于酶標儀450 nm處測定各孔吸光度值，以上實驗每組至少4個復孔，至少重復3次。

1.2.4細胞內(nèi)ROS水平測定：將處于對數(shù)生長期的HCAECs細胞制成細胞懸液，以2.5×104/ml濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml。待細胞貼壁生長良好后分組處理，結束后吸去上清，每孔加入500 μl Hoechst處理5 min，吸去上清，溫熱PBS沖洗3次，按照說明書原位裝載DCFH-DA探針，熒光顯微鏡下檢測ROS的水平，以上實驗至少重復3次。

1.2.5細胞內(nèi)SOD和T-AOC檢測：HCAECs細胞分組處理后，用細胞刮收集細胞并使用BCA試劑盒檢測蛋白含量，然后使用相應試劑盒分別應用WST-1檢測SOD活性和ABTS法檢測T-AOC，以上實驗每組至少4個復孔，至少重復3次。

1.2.6qRT-PCR法檢測細胞內(nèi)炎性因子及黏附分子mRNA含量：按照細胞RNA提取試劑盒說明書提取各組總RNA，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR儀進行檢測。β-actin、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)、IL-1β、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)、E-選擇素擴增引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素的mRNA相對表達量，以上實驗至少重復3次。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.7Western blot法檢測細胞中IL-1β、IL-6、Nrf2、HO-1、p-NF-κB、ZO-1蛋白表達：收集細胞，預冷PBS沖洗，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測定細胞提取液中總蛋白濃度。取總蛋白25 μg上樣至SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫下封閉1 h，加入一抗4 ℃條件下孵育過夜。TBST緩沖液洗滌，加入相應的二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光法顯色，以上實驗至少重復3次。

2 結果

2.1PF及TNF-α對HCAECs細胞增殖的影響 不同濃度PF均對HCAECs細胞增殖無明顯影響(P>0.05)；TNF-α濃度<50 ng/ml對HCAECs細胞增殖無明顯影響(P>0.05)，而TNF-α濃度為50 ng/ml能明顯抑制HCAECs細胞增殖(P<0.01)。見圖1。

圖1 CCK-8法檢測PF和TNF-α對HCAECs細胞增殖的影響

2.2PF對HCAECs細胞ROS、SOD和T-AOC的影響 免疫熒光示，ROS熒光染色后細胞核呈藍染，胞質(zhì)中ROS呈綠染。Control組細胞ROS熒光較弱，PF組細胞ROS熒光強度較Control組無明顯變化，KD組細胞ROS熒光強度較Control組增強，PF+KD組細胞ROS熒光強度較KD組降低。與Control組比較，PF組SOD活性和T-AOC差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，KD組SOD活性和T-AOC降低(P<0.05,P<0.01)；與KD組比較，PF+KD組SOD活性和T-AOC升高(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 PF對HCAECs細胞ROS、SOD、T-AOC的影響

2.3PF對HCAECs細胞炎性因子及黏附分子mRNA表達的影響 與Control組比較，PF組IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而KD組上述mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與KD組比較，PF+KD組IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素mRNA表達明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

圖3 PF對HCAECs細胞炎性因子及黏附分子mRNA表達的影響

2.4PF對HCAECs細胞IL-1β和IL-6蛋白表達的影響 與Control組比較，PF組IL-1β和IL-6蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而KD組上述蛋白表達升高(P<0.01)；與KD組比較，PF+KD組IL-1β和IL-6蛋白表達降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 PF對HCAECs細胞IL-1β和IL-6蛋白表達的影響

2.5PF對HCAECs細胞Nrf2/HO-1和p-NF-κB信號通路蛋白表達的影響 與Control組比較，PF組Nrf2、HO-1、Keap1、p-NF-κB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而KD組Nrf2、HO-1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Keap1、p-NF-κB蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與KD組比較，PF+KD組Nrf2、HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)，Keap1、p-NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖5。

圖5 PF對HCAECs細胞Nrf2/HO-1和p-NF-κB信號通路蛋白表達的影響

2.6PF對HCAECs細胞緊密連接蛋白ZO-1表達的影響 與Control組比較，PF組ZO-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而KD組ZO-1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與KD組比較，PF+KD組ZO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 PF對HCAECs細胞ZO-1蛋白表達的影響

3 討論

KD的病因及發(fā)病機制尚不明確，環(huán)境、免疫、遺傳等均可導致其發(fā)生[8-10]。目前，多認為KD血管內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙與T淋巴細胞和B淋巴細胞介導的免疫應答及細胞因子級聯(lián)放大效應密切相關。在KD急性期異?；罨拿庖呒毎尫糯罅康难仔越橘|(zhì)和細胞因子可直接損傷血管內(nèi)皮細胞，導致內(nèi)皮細胞功能障礙。受損的內(nèi)皮細胞在TNF-α等炎性介質(zhì)的刺激下，引起細胞間黏附分子、內(nèi)皮淋巴細胞間黏附分子等過表達，致使循環(huán)中活化的免疫細胞、血小板等向受損血管表面募集，引起更深層次血管壁的免疫損傷。其中，TNF-α作為KD最重要的促炎細胞因子，在體內(nèi)和體外的不同研究中已證實可增加內(nèi)皮細胞屏障的通透性[11]，降低內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達[12]。同時，研究也發(fā)現(xiàn)KD冠狀動脈病變患兒血清中ZO-1水平較低[13]，這意味著ZO-1可能參與了KD血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生和(或)發(fā)展。本研究采用TNF-α刺激HCAECs細胞，在體外建立KD血管內(nèi)皮細胞損傷模型。

氧化應激通常是由氧化與抗氧化能力失衡引起的，ROS過量產(chǎn)生或抗氧化能力下降通常會引起氧化應激，導致嚴重的細胞損傷和(或)細胞凋亡[14]。此前報道稱，TNF-α處理可誘導細胞ROS的產(chǎn)生[15]。升高的ROS激活典型的NF-κB途徑，導致下游炎性因子的分泌。Nrf2是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，原則上Nrf2可通過上調(diào)抗氧化能力來阻止TNF-α介導的NF-κB活化。然而NF-κB和Keap1的相互作用導致Nrf2-ARE通路被抑制[16]。還有學者發(fā)現(xiàn)，在慢性炎癥過程中，Nrf2激活可使氧化還原平衡恢復，促進細胞修復并限制TNF-α誘導的ROS產(chǎn)生及炎癥[17]。

目前，KD治療主要采用靜脈注射免疫球蛋白，但靜脈注射免疫球蛋白對部分難治性病例作用有限，且免疫球蛋白價格昂貴。因此，積極尋找治療KD的替代性或輔助性藥物意義重大。PF是芍藥的主要活性成分，是一種單帖苷類化合物[18-20]。以往對PF的研究表明，PF可通過改變多種核轉(zhuǎn)錄因子的表達或活性發(fā)揮生物學效應，如抑制在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、炎性因子產(chǎn)生和細胞存活中起重要作用的NF-κB活化[21]，抑制在癌癥、炎癥和免疫應答調(diào)節(jié)中具有有益作用的轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3激活[22-23]，減少在抗氧化、抗炎和抗凋亡中發(fā)揮重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2降解等[24-26]。本研究結果顯示，PF可抑制TNF-α誘導HCAECs細胞Nrf2的降解和NF-κB的活化。

綜上所述，PF可通過抑制氧化應激和炎癥，減輕TNF-α誘導的KD血管內(nèi)皮屏障功能損傷，這可能與PF激活Nrf2/HO-1和抑制NF-κB信號通路有關，本研究可為中藥防治KD冠狀動脈損傷提供新的理論依據(jù)。但本研究僅觀察了PF對體外KD血管內(nèi)皮細胞模型中氧化應激和炎癥的影響，并未在動物實驗中進行驗證，后續(xù)將通過完善動物實驗來驗證該結論。