邢亨特，梁傳財(cái)，王晨宇，邱 波

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA)是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，常伴隨關(guān)節(jié)軟骨退變、骨質(zhì)改變和關(guān)節(jié)滑膜炎癥等病理變化。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為性別、衰老、肥胖、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和遺傳易感性等因素與OA的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，但其確切致病因素現(xiàn)尚無定論[1]。近年，越來越多的研究證實(shí)了OA與代謝綜合征有密切聯(lián)系，因二者的核心都是慢性低度全身性炎癥，有學(xué)者甚至認(rèn)為OA可能屬于代謝綜合征的范疇[2]。代謝綜合征被認(rèn)為是導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心血管疾病和糖尿病的危險因素[3]。有研究顯示，與普通人群相比，OA患者患動脈粥樣硬化的風(fēng)險更高,其中脂質(zhì)代謝的改變可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，OA患者的軟骨細(xì)胞中存在特異性脂質(zhì)沉積，而膽固醇的異常沉積能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。還有研究顯示，高膽固醇血癥能觸發(fā)軟骨細(xì)胞的線粒體過度氧化應(yīng)激，促進(jìn)其凋亡和炎癥反應(yīng)。有細(xì)胞水平研究也發(fā)現(xiàn)，在外源性給予膽固醇后，可加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)軟骨的質(zhì)量[6-7]。可見，膽固醇在OA的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，故調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量可能延緩OA的進(jìn)展。

目前，二甲雙胍(MET)是治療2型糖尿病的一線藥物之一。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MET除了降糖的作用外，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面也發(fā)揮著出色的作用[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，MET能通過降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中膽固醇含量，抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[10]。此外，還有研究顯示MET可降低血液總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平，這可能是治療動脈粥樣硬化和2型糖尿病的有效策略[8]?？梢?，MET的降脂活性可能對多種疾病具有一定療效，但其對OA的療效鮮有報(bào)道。因此，本研究構(gòu)造Wistar大鼠OA軟骨細(xì)胞模型，分析MET對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成、降解及膽固醇合成通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討膽固醇對OA軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為OA發(fā)病機(jī)制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 qRT-PCR儀(美國ABI公司)，紫外分析儀(北京君意有限公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermofisher公司)，倒置顯微鏡(廣州明美科技有限公司)，微量分光光度計(jì)(杭州奧勝儀器有限公司)，Trizol(美國Amibon公司)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司)，兔多抗Ⅱ型膠原蛋白(ColⅡ)、兔多抗SREBP-2(美國Affinity公司)，兔多抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，兔多抗HMGCR(英國Abcam公司)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(美國Pepeotech公司)，MET(上海阿拉丁公司)，CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)，總膽固醇(TCH)測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2Wistar大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和處理 在無菌環(huán)境下處死Wistar大鼠，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪刀剪碎，用0.1%胰蛋白酶浸泡60 min，在培養(yǎng)箱中過夜；收集消化后的細(xì)胞，重懸在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；然后將培養(yǎng)基中的軟骨細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用第二代軟骨細(xì)胞。

1.3細(xì)胞存活率檢測 采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測。取生長狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞以5×103個接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜；用IL-1β(1 ng/ml)和不同濃度MET(5、10、15 mmol/L)對細(xì)胞處理24 h。每孔加入10 μl CCK-8反應(yīng)液，37 ℃培養(yǎng)2 h;用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD)值,波長450 nm,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞mRNA表達(dá)檢測 采用TRIzol法提取軟骨細(xì)胞總RNA。用cDNA合成試劑盒合成互補(bǔ)鏈DNA；采用SYBR Green Marter Mix 實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測目的基因的mRNA表達(dá)，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用ABI Quant Studio6 對cDNA進(jìn)行定量分析。熱循環(huán)條件：95 ℃孵育10 min，95 ℃變性15 s，共40個擴(kuò)增循環(huán)，60 ℃退火延伸。以GAPDH為內(nèi)參，比較定量采用2-ΔΔCt法。引物序列(5'-3')：GAPDH上游ACAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，產(chǎn)物253 bp；MMP-13上游ACCAGAGAAGTGTGACCCAG，下游CTCGGGATGGATGCTCGTAT，產(chǎn)物191 bp；ColⅡ上游TGACTTTCCTCCGTCTACTGTC，下游AGGTCTTCTGTGATCGGTACTC，產(chǎn)物249 bp。

1.5關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白提取 用預(yù)冷的PBS洗滌3次軟骨細(xì)胞，然后用RIPA裂解液溶解細(xì)胞，按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)，搖勻置于冰上。裂解完后將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中，離心后取上清于離心管中放置于-20℃保存。用于后續(xù)Western Blot法檢測原代軟骨細(xì)胞目的基因的表達(dá)。

1.6關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH含量 采用TCH測定試劑盒檢測軟骨細(xì)胞TCH含量。通過裂解和離心收集細(xì)胞，然后根據(jù)試劑盒說明書，在96孔板上操作，并使用酶標(biāo)儀測量每個孔的OD值，波長510 nm。

2 結(jié)果

2.1關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞CCK-8法檢測結(jié)果 在用IL-1β制備的OA軟骨細(xì)胞模型中分別加入濃度為5、10、15 mmol/L的MET處理24 h后，進(jìn)行CCK-8法細(xì)胞增殖分化活性檢測，發(fā)現(xiàn)在MET濃度為10 mmol/L時細(xì)胞增殖分化活性較佳，見圖1，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用濃度為10 mmol/L MET進(jìn)行。

圖1 Wistar大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞CCK-8法檢測結(jié)果

2.2MET對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成和降解的影響 與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞ColⅡ mRNA顯著降低，而MMP-13 mRNA則顯著升高(P<0.05)。與OA軟骨細(xì)胞比較，經(jīng)10 mmol/L MET干預(yù)后的OA軟骨細(xì)胞Col Ⅱ mRNA明顯升高，MMP-13 mRNA顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 MET對Wistar大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成和降解的影響

2.3MET對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膽固醇合成通路的影響 與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)蛋白明顯升高(P<0.01)。與OA軟骨細(xì)胞比較，經(jīng)10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細(xì)胞SREBP-2和HMGCR蛋白顯著降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 MET對Wistar大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膽固醇合成通路的影響

2.4MET對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH的影響 與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞TCH明顯升高(P<0.01)。與OA軟骨細(xì)胞比較，經(jīng)10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細(xì)胞TCH顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 MET對Wistar大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TCH的影響

3 討論

OA是導(dǎo)致老年患者慢性殘疾的主要原因，其病因復(fù)雜多樣，尚無定論。近年，越來越多的學(xué)者認(rèn)為脂質(zhì)代謝異?？赡芘cOA的發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)分泌器官的脂肪含量增加被證明是關(guān)節(jié)異常負(fù)荷和脂肪因子、炎性因子過度產(chǎn)生的原因[11-12]。有研究顯示膽固醇代謝失調(diào)與軟骨細(xì)胞中異常脂肪堆積有關(guān)，從而導(dǎo)致OA表型產(chǎn)生[13]。還有文獻(xiàn)報(bào)道在家族性高膽固醇血癥患者關(guān)節(jié)內(nèi)也能見到明顯的膽固醇沉積，可能與手部OA發(fā)生密切相關(guān)[14]。因此，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)異常膽固醇代謝可能對OA治療發(fā)揮作用。

隨著研究的不斷深入，MET的諸多潛在作用被發(fā)現(xiàn)，它可能對多種疾病具有一定作用。在肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中，F(xiàn)ENG等[15]研究顯示MET可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路，延緩軟骨衰老和退化。還有研究發(fā)現(xiàn)，MET能減輕OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和線粒體損傷；此外，MET還能通過AMPK/SIRT1通路，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬與凋亡之間的相互作用，抑制OA表型表達(dá)，抑制OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞ColⅡmRNA顯著降低，而MMP-13 mRNA和TCH顯著升高；與OA軟骨細(xì)胞比較，經(jīng)10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細(xì)胞Col Ⅱ mRNA明顯升高，而MMP-13 mRNA和TCH顯著降低。說明IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞TCH表達(dá)顯著升高，而MET能有效降低OA軟骨細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，同時促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的ColⅡmRNA表達(dá)，抑制OA軟骨細(xì)胞MMP-13 mRNA表達(dá)。提示MET能減少軟骨細(xì)胞內(nèi)TCH含量，促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成，抑制基質(zhì)降解，保護(hù)軟骨。

膽固醇是細(xì)胞膜的重要成分，包括軟骨細(xì)胞在內(nèi)的多類細(xì)胞都能通過生物合成途徑合成膽固醇，并且在其生物合成途徑中與其他中間體一起調(diào)控信號分子[18]。有研究表明，膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其中SREBP-2參與激活膽固醇代謝和生物合成基因[7]。KOSTOPOULOU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-33a通過轉(zhuǎn)化生長因子/Akt/SREBP-2途徑調(diào)控OA軟骨細(xì)胞中膽固醇的合成，并且HMGCR作為SREBP-2靶基因，在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)是顯著升高的。本研究結(jié)果顯示，與正常軟骨細(xì)胞比較，OA軟骨細(xì)胞SREBP-2和HMGCR蛋白明顯升高；與OA軟骨細(xì)胞比較，經(jīng)10 mmol/L MET處理后的OA軟骨細(xì)胞SREBP-2和HMGCR蛋白顯著降低。說明MET能減少OA軟骨細(xì)胞膽固醇合成通路中關(guān)鍵基因SREBP-2和HMGCR蛋白表達(dá)，結(jié)合胞內(nèi)TCH表達(dá)的變化，提示MET可能通過減弱軟骨細(xì)胞SREBP-2/HMGCR通路，抑制胞內(nèi)膽固醇合成，減少膽固醇蓄積?？梢姡懝檀己铣僧惓？赡苁怯绊慜A發(fā)生和發(fā)展的因素之一。

綜上所述，MET能有效減少IL-1β誘導(dǎo)的Wistar大鼠OA軟骨細(xì)胞中的膽固醇含量，同時能夠減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而這可能是通過抑制SREBP-2/HMGCR信號通路、減少膽固醇合成實(shí)現(xiàn)的。本研究有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識膽固醇代謝與OA的關(guān)系，為OA的早期防治提供新的思路。然而，本研究尚未證明膽固醇流出通路對OA的影響，以及膽固醇合成與流出之間的相互關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。