呂 鋒，解孝滿,，韓 彪，魯儀增，王 磊，董 昕，王 艷，陸 璐，劉 莉，宗紹寧，李文清,*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林草種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102)

麻櫟(Quercusacutissima)屬于殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)，最新的櫟屬分類系統(tǒng)將其分為8組，分別為中間櫟組(Sect.Protobalanus)、本都櫟組(Sect.Ponticae)、活櫟組(Sect.Virentes)、白櫟組(Sect.Quercus)、紅櫟組(Sect.Lobatae)、青岡櫟組(Sect.Cyclobalanopsis)、冬青櫟組(Sect.Ilex)和麻櫟組(Sect.Cerris)，共 423 種[1]。其中，麻櫟屬麻櫟組，同組樹種還有栓皮櫟(Q.variabilis)和小葉櫟(Q.chenii)。麻櫟在我國分布于東經(jīng)91°～123°、北緯18°～41°的地區(qū)，是東亞暖溫帶和亞熱帶地區(qū)森林植被中重要的組成樹種之一[2]。麻櫟為喜光樹種，耐干旱瘠薄，具有良好的水土保持功能，其木材硬度大、有彈性、耐腐蝕，為優(yōu)等家具、樂器等用材。其樹皮、殼斗及果實(shí)可提取栲膠，也可藥用，具有收斂止血、澀腸固脫等功效，樹葉具有抗突變活性[3-4]。

近年來，對麻櫟種質(zhì)的相關(guān)研究主要集中在組織培養(yǎng)及扦插繁殖技術(shù)[5]、苗期生長特性[6]、優(yōu)良家系的選擇[7]和群體遺傳多樣性[8-9]等方面。對櫟屬遺傳多樣性研究也較多，如孟旭[10]利用10對nSSR引物對麻櫟33個(gè)居群510個(gè)個(gè)體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示麻櫟的遺傳多樣性水平并不高[等位基因數(shù)(Na)=5.264，有效等位基因數(shù)(Ne)=3.504，Shannon多樣性指數(shù)(I)=1.218，觀測雜合度(Ho)=0.283，期望雜合度(He)=0.595，多態(tài)性百分率(PPPL)=96.06%]。徐小林等[11]基于16對SSR分子標(biāo)記分析結(jié)果，認(rèn)為栓皮櫟5個(gè)天然群體的遺傳多樣性較豐富。秦英英等[12]利用SSR標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)山西省遼東櫟(Q.liaotungensis)群體的遺傳多樣性較高。王雁紅等[13]利用SSR分子標(biāo)記對24個(gè)短柄枹櫟群體(Q.serratavar．brevipetiolata)研究發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性不高。李文英等[14]使用等位酶和AFLP 技術(shù)研究認(rèn)為，我國8個(gè)蒙古櫟 (Q.mongolica)天然群體的遺傳多樣性水平偏低。其中，由于對遼東櫟、短柄枹櫟等的研究取樣存在局限性，群體間也存在較遠(yuǎn)的地理隔離，并不能完全反映該物種水平下的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。本研究基于前人對櫟屬植物研究的SSR引物，通過篩選出適用于麻櫟的SSR引物，并對麻櫟天然群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為麻櫟種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018—2020年在河南、遼寧、山西、云南、河北、山東、江蘇等7省的麻櫟自然分布區(qū)，共采集了8個(gè)麻櫟群體150份種質(zhì)資源。收集地點(diǎn)的經(jīng)度和緯度用GPS定位軟件記錄，各居群的采樣樣本數(shù)見表1。為保證樣品具有代表性且避免采集到同一家系的個(gè)體，群體內(nèi)隨機(jī)選取成年大樹，且每個(gè)樣本個(gè)體至少間隔50 m。采集新鮮無病斑的麻櫟葉片，使用硅膠干燥保存。

表1 采樣點(diǎn)基本信息

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

1.2.1 基因組DNA提取

利用DNA提取試劑盒(9768)(寶生物，大連)提取所有麻櫟樣本，用ND-2000紫外分光光度計(jì)(上海天能科技有限公司，上海)對其DNA濃度進(jìn)行檢測，并采用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，放置-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及電泳檢測

PCR反應(yīng)在Veriti 96孔快速梯度PCR儀(ABI，美國)上完成，25 μL PCR反應(yīng)體系如下：10 ×TaqBuffer(with MgCl2)2.5 μL，10 μmol/L dNTP(mix)1 μL，20 ng模板DNA，10 μmol/L正、反向引物各1 μL，5 U/μL的Taq0.5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)為35次；最后72 ℃延伸6 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃條件下保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經(jīng)銀染法染色并顯色后，在凝膠成像儀(上海復(fù)日科技有限公司)上拍照保存。

1.2.3 SSR引物篩選

由于微衛(wèi)星兩端的序列是比較保守的，所以同屬物種之間的差異很小，SSR引物具有通用性[15]，SSR引物來自前人已開發(fā)的櫟屬SSR引物[16]，由上海生工生物有限公司合成，從56對引物中篩選出了18對穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的引物(表2)用于后續(xù)試驗(yàn)。將篩選出的引物和DNA樣品送至上海生工生物有限公司進(jìn)行微衛(wèi)星分型試驗(yàn)。

表2 18對SSR引物序列信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Genemarker 2.2.0軟件對毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)分析，采用GenAIEx 6.51軟件[17]將數(shù)據(jù)整理，并計(jì)算各群體的遺傳多樣性參數(shù)期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性指數(shù)(I)等，并進(jìn)行主成分分析(PCoA)和AMOVA分析。同時(shí)，計(jì)算遺傳分化系數(shù)(Fst)，并根據(jù)公式Nm=(1-Fst)/4Fst[18]計(jì)算基因流(Nm)。基于Nei’s遺傳距離，使用MEGA 7.0.26[19]軟件基于非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行群體聚類。

利用Structure 2.3.4軟件[20]對麻櫟群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，設(shè)置K值為2～7，每個(gè)K值的運(yùn)行次數(shù)為10次，每次不作數(shù)迭代(length of burn-in period)和MCMC(Markov chain monte carlo)均設(shè)置為100 000次，采用ΔK法進(jìn)行聚類數(shù)值設(shè)定，使用Structure Harvester計(jì)算ΔK的最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)的多樣性

18個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性、F檢驗(yàn)及基因流估算結(jié)果見表3。由表3可知，平均等位基因?yàn)?.625個(gè)，等位基因數(shù)(Na)的變化范圍為2.000～13.125個(gè)，其中以QM58TGT位點(diǎn)的等位基因數(shù)最多，而QM67-3M1的等位基因數(shù)最少。各個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.778～9.547個(gè)，平均值為4.104個(gè)，最多的位點(diǎn)為QM58TGT，其次為MSQ16(6.944)，最少的位點(diǎn)為QM67-3M1。Shannon多樣性指數(shù)(I)的變化范圍為0.632～2.267，平均為1.338。各個(gè)位點(diǎn)的觀測雜合度(Ho)為0.625～1.000，平均為0.895。期望雜合度(He)的變化范圍為0.444～0.861，平均為0.645。表明篩選出的18對麻櫟SSR引物具有豐富的多態(tài)性。

表3 18個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性、F檢驗(yàn)及基因流估算

2.2 不同麻櫟群體的遺傳多樣性

麻櫟群體遺傳多樣性分析見表4。麻櫟群體等位基因數(shù)(Na)為2.278～10.389個(gè)，平均為5.625個(gè)，山東魯中南群體(LZN)的最高，云南群體(YN)的最低。有效等位基因數(shù)(Ne)為2.102～6.405個(gè)，平均為4.104個(gè)，山東魯中南群體(LZN)的最高，云南群體(YN)的最低。Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.748～1.929，平均為1.338，山東魯中南群體(LZN)的最高，云南群體(YN)的最低。觀測雜合度(Ho)為0.722～1.000，平均為0.895。期望雜合度(He)為0.441～0.805，平均為0.645。多態(tài)性百分率(PPPL)平均為89.58%。以上說明麻櫟群體的遺傳多樣性豐富，遺傳多樣性水平較高。各群體的固定系數(shù)(F)均小于0，均值是-0.441，說明麻櫟群體內(nèi)的基因型分布不平衡，各群體中存在雜合子剩余，種群內(nèi)存在較多的雜交和遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

表4 麻櫟群體遺傳多樣性

2.3 不同麻櫟群體的遺傳分化

麻櫟群體的遺傳分化系數(shù)(Fst)平均為0.252，表明麻櫟群體間的遺傳分化中等?；蛄?Nm)為0.240～3.312，平均為1.140，亦表明麻櫟群體間可能發(fā)生遺傳分化的程度較小(表3)。AMOVA(表5)分析結(jié)果顯示，麻櫟群體的變異主要發(fā)生在群體內(nèi)(98%)，而只有2%的變異發(fā)生在群體間。

表5 麻櫟群體分子方差分析表

2.4 麻櫟天然群體間遺傳關(guān)系分析

8個(gè)麻櫟天然群體的遺傳相似度與遺傳距離分析顯示(表6)，麻櫟群體間的遺傳距離為0.222～1.587，遺傳相似度為0.205～0.801。其中，遼寧群體(LN)和魯中南群體(LZN)群體間的遺傳距離最小，遺傳一致度最大；云南群體(YN)和江蘇群體(JS)群體的遺傳距離最大，其遺傳一致度最小。

表6 麻櫟8個(gè)天然群體遺傳相似度與遺傳距離

根據(jù)歐氏距離類平均法(UPGMA)對8個(gè)麻櫟天然群體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)歐式距離為12時(shí)，可以將8個(gè)群體劃分為2組，其中，Cluster1包括遼寧群體(LN)、河北群體(HB)、山東魯東(JD)群體、山東魯中南(LZN)群體、江蘇群體(JS)、山西群體(SX)，各群體間的距離依次增大，親緣關(guān)系逐漸變遠(yuǎn)。Cluster1包括2個(gè)亞組，其中Cluster1A，包含1個(gè)群體，為山西群體(SX)；Cluster1B包括其他5個(gè)群體。Cluster 2只包括2個(gè)群體，分別為河南群體(HN)、云南群體(YN)，其與上述Cluster1的群體間的距離最大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。上述麻櫟群體總體呈現(xiàn)出沿“東北—西南”方向的地理變異規(guī)律。

圖1 8個(gè)麻櫟居群UPGMA聚類樹

對8個(gè)麻櫟群體的150個(gè)個(gè)體的主成分分析顯示(圖2)，西南方向群體[河南群體(HN)與云南群體(YN)]的不同個(gè)體基本聚在一起，山東魯中南群體(LZN)的少量個(gè)體遷入；河南群體(HN)的少數(shù)個(gè)體遷出，并與其他6個(gè)群體的個(gè)體聚在一起。東北方向麻櫟群體的個(gè)體之間聚類后仍較為分散，規(guī)律性不強(qiáng)，其可能存在交叉引種或者基因漸滲等現(xiàn)象。

圖2 麻櫟群體150個(gè)個(gè)體主成分分析結(jié)果

2.5 不同麻櫟群體間遺傳結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步研究麻櫟群體間的遺傳關(guān)系，基于貝葉斯方法對8個(gè)麻櫟群體進(jìn)行Structure分析(圖3)結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK值最大(圖3A)，表明150份麻櫟材料可能來自2個(gè)不同的理想類群。按照相似度對不同個(gè)體進(jìn)行歸類，可分為紅色標(biāo)注群體和綠色標(biāo)注群體(圖3B)。其中，云南群體(YN)的全部個(gè)體，河南群體(HN)的大部分個(gè)體，江蘇群體(JS)、山西群體(SX)、山東魯東(JD)和魯中南群體(LZN)的少量個(gè)體，它們之間的相似度高，歸為一類，為紅色標(biāo)注群體；遼寧群體(LN)全部個(gè)體，江蘇群體(JS)、山西群體(SX)、山東魯東(JD)和魯中南群體(LZN)的多數(shù)個(gè)體，河南群體(HN)的少量群體，它們之間的相似度高，歸為另一類，為綠色標(biāo)注群體。部分個(gè)體的遺傳信息顯示來自上述兩個(gè)群體。進(jìn)一步表明，麻櫟群體沿“西南—東北”方向加劇分化，并且在部分群體之間存在基因漸滲現(xiàn)象。在聚類分析中也觀察到類似的結(jié)果，筆者還發(fā)現(xiàn)了Structure分析和聚類分析之間的一些差異，這可能是因?yàn)榫垲惙治鰹槊織l線分配了一個(gè)固定的分支位置，而結(jié)構(gòu)分析導(dǎo)致了將個(gè)體分配給組的亞群成員百分比[21]。

圖3 基于貝葉斯分析的麻櫟居群Structure聚類結(jié)果

3 討 論

3.1 麻櫟群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種長期生存和進(jìn)化最基礎(chǔ)的條件[22]，遺傳多樣性越高，物種適應(yīng)環(huán)境的能力就越強(qiáng)[23]。本研究中麻櫟群體的等位基因數(shù)(Na)平均為5.625個(gè)，有效等位基因數(shù)(Ne)平均為4.104個(gè)，Shannon多樣性指數(shù)(I)平均為1.338，觀測雜合度(Ho)平均為0.895，期望雜合度(He)平均為0.645，表明麻櫟群體的遺傳多樣性豐富，遺傳多樣性水平較高。這與葉青雷等[8]、彭禮瓊等[9]分別基于SRAP和 ISSR標(biāo)記得到的結(jié)論基本一致。但低于部分櫟屬其他植物的遺傳多樣性。其原因可能為，麻櫟屬于風(fēng)媒傳粉的植物，距離增加會(huì)降低花粉的濃度和傳播效率，使產(chǎn)生的種子數(shù)量下降，隨著距離增加，孤立的個(gè)體更容易發(fā)生近交產(chǎn)生種子[24]；人為活動(dòng)如砍伐、移植等的影響會(huì)使麻櫟群體范圍縮小，降低了其遺傳多樣性[25-26]；另外，SSR標(biāo)記的無效等位基因廣泛存在，也是影響其遺傳多樣性的一個(gè)重要原因[27]。

3.2 麻櫟群體遺傳分化

群體的遺傳結(jié)構(gòu)改變是由于隨機(jī)的遺傳漂變及基因流的隔離[28]。Kremer 等[29]研究表明櫟屬種內(nèi)群體間的遺傳分化很小，分化系數(shù)在0. 01～0. 17，平均值為 0. 06。本研究中麻櫟的群體間遺傳的遺傳分化程度亦不高(Fst=0.252，0.007～0.051)，僅有2%的遺傳變異發(fā)生在群體間，而在群體內(nèi)的遺傳變異達(dá)到了98%。Hamrick等[30]研究顯示基因流Nm>4時(shí)，群體間的基因交換相對充分，從而抵抗遺傳漂變，防止群體間因遺傳漂變而發(fā)生遺傳分化。本研究的基因流平均為1.140(0.240～3.312)，進(jìn)一步說明麻櫟群體間存在遺傳漂變，且其遺傳分化程度較低。這與櫟屬植物的高遺傳性和低遺傳分化的普遍現(xiàn)象是基本吻合的[2]。

3.3 麻櫟群體的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳變異在空間分布上產(chǎn)生遺傳分化，造就了一個(gè)物種種群的遺傳結(jié)構(gòu)[31]。群體遺傳結(jié)構(gòu)很大程度上受人為活動(dòng)的影響，如對次生林分的改造行為[32]，本研究采樣的林分多屬于次生林，林分生長過程中的不同環(huán)節(jié)，如交配、繁殖、地理分布范圍改變及遺傳交流等都會(huì)改變其群體的遺傳結(jié)構(gòu)[33]。Structure分析和UPGMA聚類分析中，均將麻櫟群體分為2組，PCoA對麻櫟個(gè)體之間的分析結(jié)果與其基本一致。并且群體之間呈現(xiàn)出沿“東北—西南”方向的變異規(guī)律。但是群體間存在交叉引種或基因漸滲現(xiàn)象。

3.4 麻櫟的保護(hù)建議

野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，麻櫟自然群體多為零星分布，人類的活動(dòng)使麻櫟所處生境嚴(yán)重片段化。因此，應(yīng)切實(shí)地保護(hù)麻櫟的生存環(huán)境，并且通過有效措施來阻止人為活動(dòng)造成的破壞，逐漸恢復(fù)群體的生機(jī)。另外，可通過運(yùn)用常規(guī)方法與分子生物學(xué)技術(shù)來研究和評(píng)價(jià)麻櫟遺傳多樣性，制定相應(yīng)的原地保存與遷地保存策略，開展櫟類樹種的雜交育種工作，加快培育速生、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種，以此來豐富麻櫟資源的遺傳多樣性。本研究基于SSR分子標(biāo)記的麻櫟遺傳多樣性表明，麻櫟在物種水平上的遺傳多樣性水平較高，但是，西南方向群體相對于東北群體的遺傳多樣性低。在開展保護(hù)麻櫟種質(zhì)資源時(shí)，首先對其野生群體及其生境進(jìn)行原地保護(hù)，遺傳多樣性高的群體應(yīng)重點(diǎn)保護(hù)，當(dāng)然對于邊緣地區(qū)的保護(hù)也不能放棄；還可以在全分布區(qū)建立長期觀測種源的試驗(yàn)基地，基于當(dāng)前及未來研究目標(biāo)建立麻櫟種質(zhì)資源遷地保存庫，合理利用麻櫟資源[34]。