鄒惠影，李俊良，朱化彬

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

隨著生命體基因組序列的揭示及生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)基因組上的堿基進(jìn)行精確改造一直是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的研究課題。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系統(tǒng)是繼TALEN、ZFN之后的又一重大突破，它的出現(xiàn)開啟了基因編輯的新時(shí)代，在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)林畜牧等方面展示出了巨大的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9核酸酶和單向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)組成，sgRNA招募Cas9蛋白結(jié)合到靶位點(diǎn)，Cas9識(shí)別靶位點(diǎn)下游的 PAM(protospacer adjacent motif, PAM)基序，并對(duì)PAM上游3～5 nt進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，發(fā)生非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)，該過程可引入片段的插入或缺失；或在供體DNA存在下發(fā)生同源介導(dǎo)修復(fù)(homology-directed repair, HDR)，進(jìn)行精確修復(fù)[1-3]。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的操作簡(jiǎn)單及高效編輯，該系統(tǒng)已經(jīng)在動(dòng)物、植物和微生物中進(jìn)行廣泛應(yīng)用，包括遺傳育種、特定遺傳性疾病的修復(fù)、潛在藥物靶標(biāo)的驗(yàn)證和全基因組篩選挖掘基因生物學(xué)功能[4-6]?？蒲泄ぷ髡邔RISPR/Cas9系統(tǒng)分別與胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶整合，發(fā)明了高效誘導(dǎo)單堿基編輯的單堿基編輯系統(tǒng)，包括胞嘧啶單堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)[7]和腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor, ABE)[8]。CBE能夠?qū)/G向T/A轉(zhuǎn)變，而ABE則可將A/T轉(zhuǎn)變成G/C。然而，單堿基編輯器會(huì)在高效編輯單堿基的同時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的脫靶突變，并且不能實(shí)現(xiàn)堿基之間的顛換(A-T或C-G)[9-10]。

引導(dǎo)編輯 (prime editing, PE) 系統(tǒng)是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)新研發(fā)出的一項(xiàng)靶基因修飾技術(shù)，在無(wú)需供體DNA存在下可以實(shí)現(xiàn)任意堿基的互換、短片段的插入和缺失，是基因修飾強(qiáng)有力的工具，將基因編輯提升了一個(gè)新的水平[11]。PE系統(tǒng)將會(huì)在精準(zhǔn)育種、糾正致病性的遺傳突變和構(gòu)建動(dòng)物疾病模型等方面有廣闊的應(yīng)用前景。

1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的概況及特點(diǎn)

2019年，Anzalone等[11]開發(fā)了“search and replace”全新基因編輯技術(shù)-prime editing系統(tǒng)，被Nature 雜志評(píng)論是“超精確的新型基因編輯工具”。PE系統(tǒng)包括Cas9切口酶(Cas9 nickase，nCas9)、反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)和引導(dǎo)編輯向?qū)NA(prime editing guide RNA，pegRNA)，其中nCas9與RT融合在一起。pegRNA包括引導(dǎo)nCas9結(jié)合靶位點(diǎn)的spacer(sgRNA)、primer binding site (PBS)和目標(biāo)序列(RT以此序列為模板將新的遺傳信息寫進(jìn)基因組里，被稱為RT模板)。pegRNA引導(dǎo)nCas9-RT復(fù)合體結(jié)合到基因靶位點(diǎn)，nCas9在PAM序列上游3 nt產(chǎn)生切口，切割鏈3′端與PBS互補(bǔ)結(jié)合，之后RT以RT模板進(jìn)行延伸合成新的堿基信息(圖1)。攜帶3′ 端編輯Flap的編輯產(chǎn)物與攜帶5′端非編輯Flap的產(chǎn)物穩(wěn)定平衡，其中5′端非編輯Flap被核酸酶切除可以獲得一條編輯鏈和一條非編輯鏈的產(chǎn)物，在細(xì)胞修復(fù)后最終獲得穩(wěn)定編輯的DNA。

圖1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的構(gòu)成及工作模式

PE系統(tǒng)不需要供體DNA，并且不需要產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSB)，即可實(shí)現(xiàn)堿基之間的自由替換及目標(biāo)位點(diǎn)堿基精確插入與刪除(插入的堿基長(zhǎng)度可達(dá)44 bp，刪除的堿基長(zhǎng)度可達(dá)80 bp)[11]。與單堿基編輯系統(tǒng)相比，對(duì)于位于單堿基編輯器編輯窗口(4～8 nt)的CG或AT， PE系統(tǒng)在大部分位點(diǎn)的編輯效率較低，并且會(huì)引入更多的插入缺失突變。但是在精準(zhǔn)度方面，PE系統(tǒng)能準(zhǔn)確編輯目標(biāo)堿基，而單堿基編輯器在編輯窗口有多個(gè)可編輯的CG或AT的情況下會(huì)產(chǎn)生多種編輯產(chǎn)物，其中只編輯目標(biāo)堿基的產(chǎn)物占比較少。對(duì)于小片段插入和缺失的精確編輯，與CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR相比，PE系統(tǒng)不需要供體DNA，產(chǎn)生更少的由于DBS誘發(fā)的插入缺失突變，而編輯效率與HDR相近(表1)。

表1 PE系統(tǒng)、BE系統(tǒng)和HDR的比較

2 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的優(yōu)化

為了提高PE系統(tǒng)的編輯效率，Anzalone等[11]對(duì)Prime編輯器(prime editor，PE)進(jìn)行了優(yōu)化與改進(jìn)。在PE1中，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,M-MLV RT)與nCas9(H840A)的C端連接，并在同一個(gè)質(zhì)粒中表達(dá)。PE1介導(dǎo)的單堿基替換效率依賴PBS的長(zhǎng)度，編輯效率為0.7%～5.5%；PE1介導(dǎo)的堿基的插入與缺失效率為4%～17%。為了提高M(jìn)-MLV RT的耐熱性、持續(xù)合成能力和DNA/RNA結(jié)合能力，研究者在M-MLV RT中引入5個(gè)突變(D200N/L603W/T330P/T306K/W313F)，將單堿基突變效率提高了1.6～5.1倍，這個(gè)改造后的系統(tǒng)被稱為PE2[11]。研究表明，在非編輯鏈引入一個(gè)切口可以促使以編輯鏈為模板進(jìn)行DNA修復(fù)，從而提高編輯效率，因此，在PE2的基礎(chǔ)上，引入一個(gè)經(jīng)典sgRNA與靶位點(diǎn)結(jié)合，引導(dǎo)nCas9在非編輯鏈產(chǎn)生切口，突變效率提高了3倍，這個(gè)系統(tǒng)被稱為PE3[11]。研究顯示，非編輯鏈切口距離編輯鏈切口約50 bp時(shí)的編輯效率較高。如果設(shè)計(jì)的sgRNA只能與編輯后序列匹配，與原序列不匹配，那么nCas9會(huì)在編輯鏈Flap拆分之后才在非編輯鏈產(chǎn)生切口，這樣可以減少產(chǎn)生非必要的脫靶突變，這種設(shè)計(jì)策略被稱為PE3b[11]。

為了進(jìn)一步提高PE系統(tǒng)的編輯效率，Chen等[12]進(jìn)行了CRISPR干擾(CRISPR interference, CRISPRi)篩選，發(fā)現(xiàn)DNA錯(cuò)配修復(fù)(DNA mismatch repair, MMR)相關(guān)基因抑制了PE的效率，并促進(jìn)產(chǎn)生indel副產(chǎn)物。為解決這一問題，他們嘗試與PE系統(tǒng)共表達(dá)MMR通路相關(guān)基因顯性負(fù)性突變體(dominant negative MLH1, MLH1 dn)，結(jié)果顯示MLH1 dn能有效增強(qiáng)PE的基因編輯效率。PE2與MLH1 dn的組合被稱為PE4，PE3與MLH1 dn的組合稱為PE5。與相應(yīng)的PE2和PE3相比，PE4和PE5的編輯效率分別提高了7.7倍和2倍，并且目標(biāo)編輯產(chǎn)物的純度提高了3.4倍[12]。之后，Da Silva等[13]也得出MMR能夠抑制PE系統(tǒng)的結(jié)論；通過消除MMR，PE系統(tǒng)的效率提高了2～17倍。

除此之外，科研工作者還在擴(kuò)展PE系統(tǒng)的編輯范圍(刪除和插入)、nCas9-MMLV融合蛋白的結(jié)構(gòu)、pegRNA的設(shè)計(jì)、PE系統(tǒng)的遞送、抗藥性篩選和報(bào)告系統(tǒng)富集編輯細(xì)胞等方面對(duì)PE系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。

Jiang等[14]和Choi等[15]在PE系統(tǒng)基礎(chǔ)上分別研發(fā)了PE-Cas9-based deletion and repair (PEDAR)和PRIME-Del工具。這兩種工具都是用Cas9蛋白替換PE系統(tǒng)中的nCas9，并且在插入/刪除位置的上、下游設(shè)計(jì)一對(duì)pegRNA，借助細(xì)胞修復(fù)過程中微同源介導(dǎo)的末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)或單鏈退火(single strand annealing，SSA)途徑完成修復(fù)。PEDAR被驗(yàn)證可以精確進(jìn)行60 bp的插入和大于10 kb片段的刪除；PRIME-Del被驗(yàn)證可以精確進(jìn)行大于10 kb片段的刪除，在基因治療領(lǐng)域和基礎(chǔ)生物學(xué)蛋白質(zhì)功能研究等方法中有潛在的應(yīng)用。隨后，Anzalone等[16]開發(fā)了twin prime editing (twinPE)工具，包括原始PE系統(tǒng)的PE蛋白和兩個(gè)pegRNA。twinPE能夠高效進(jìn)行108 bp的插入和818 bp的刪除。另外，twinPE結(jié)合Bxb1 整合酶可以在基因組特定位點(diǎn)整合5.6 kb的片段和糾正長(zhǎng)達(dá)40 kb的基因倒置。twinPE工具的pegRNA在基因組的不同靶位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈缺口，相比較PEDAR 和PRIME-Del會(huì)產(chǎn)生更少的副產(chǎn)物。最近，Wang等[17]開發(fā)了GRANDE diting系統(tǒng)，利用一對(duì)特殊設(shè)計(jì)的pegRNA實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)1 kb DNA片段的靶向插入。

Liu等[18]在SpCas9與M-MLV序列的N端和C端添加了c-Myc NLS和SV40 NLS，構(gòu)成了PE2*；用SaCas9和SaCas9KKH變體替換SpCas9，構(gòu)成了SaPE2*和SaKKHPE2*。經(jīng)檢測(cè)，在小鼠轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的堿基替換、插入、缺失編輯過程中，PE2*的效率都要高于PE2的編輯效率；SaPE2*在一些位點(diǎn)編輯效率與PE2*相差不多，但是SaKKHPE2*的編輯效率一直較低。Xu等[19]構(gòu)建了PE-P2，利用自切割多肽2A串聯(lián)表達(dá)PE系統(tǒng)和篩選標(biāo)記，并采用強(qiáng)化的sgRNA，使水稻基因組中靶位點(diǎn)突變效率提高了22倍(從1.2%到26%)。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，在RT模板中引入同義錯(cuò)配堿基和nCas9的C端融合M-MLV均可提高PE系統(tǒng)的編輯效率。將這兩種策略組合使用時(shí)，出現(xiàn)了倍增協(xié)同效應(yīng)，PE系統(tǒng)在水稻中的平均編輯效率達(dá)到了24.3%，在玉米原生質(zhì)中達(dá)到了6.2%,在人細(xì)胞中達(dá)到了12.5%[20]。Lu等[21]通過密碼子優(yōu)化和CaM35S啟動(dòng)子優(yōu)化提高了PE系統(tǒng)的編輯效率。研究者還同時(shí)對(duì)nCas9-MMLV融合蛋白多個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建出具有更強(qiáng)編輯效果的PEmax。這些優(yōu)化包括MMLV的優(yōu)化密碼子、Cas9n突變體、Cas9n與MMLV添加連接序列和增加NLS序列[12]。

pegRNA的3′端延伸在PE系統(tǒng)工作時(shí)暴露在細(xì)胞中(未被融合蛋白包裹)，容易被核酸酶降解。為解決這一問題，多個(gè)課題組通過對(duì)pegRNA的3′端添加RNA結(jié)構(gòu)基序來增加pegRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高了PE系統(tǒng)的編輯效率。這些結(jié)構(gòu)基序包括G-quadruplex[22]、xrRNA[23]和tevopreQ1(trimmed evopreQ1)[24]等。添加tevopreQ1的epegRNA與MLH1 dn和 PEmax協(xié)同作用可顯著提高編輯效率，其中PE4 max和epegRNAs在Hela細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中的編輯效率分別提高了72倍和3.5倍；PE5 max和epegRNAs在Hela細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中的編輯效率分別提高了12倍和1.6倍[12]。Li等[25]通過規(guī)律性引入同義突變和pegRNA骨架優(yōu)化，開發(fā)了新型引導(dǎo)編輯系統(tǒng)sPE和aPE，提高了編輯效率。與PE3相比，sPE3的編輯效率平均提高353倍；aPE3的編輯效率平均提高2.77倍。另外，對(duì)pegRNA的優(yōu)化還包括PBS和RT模板兩方面。PBS和RT模板的長(zhǎng)度與編輯效率沒有絕對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通常需要設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的PBS進(jìn)行編輯嘗試。研究工作者建議PBS的起始長(zhǎng)度為13 nt，但是當(dāng)編輯位點(diǎn)的G/C含量超出40%～60%時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短PBS長(zhǎng)度。RT模板的建議起始長(zhǎng)度為10～16 nt，并且RT模板與sgRNA骨架3′端連接的第一個(gè)堿基不能是C，否則編輯效率會(huì)降低。Lin等[26]從PBS與切割鏈結(jié)合的緊密程度入手研究，發(fā)現(xiàn)PE系統(tǒng)在PBS的Tm值為30 ℃時(shí)編輯效率最高，Tm值過低或過高都會(huì)影響編輯效率。他們還用雙pegRNA策略對(duì)靶位點(diǎn)的雙鏈分別產(chǎn)生切口和寫入編輯序列，將編輯效率提高了1.8～4.2倍，并且沒有產(chǎn)生額外的插入/缺失突變。采用優(yōu)化的PBS結(jié)合雙pegRNA策略，PPE系統(tǒng)在水稻中的效率提高了2.9～17.4倍。

科研工作者還嘗試用piggyBac載體[27-28]、腺病毒載體[29]遞送PE系統(tǒng)或者將PE系統(tǒng)構(gòu)成一元載體[30]、將PE系統(tǒng)分離成多個(gè)載體[31]進(jìn)行基因編輯。這些改進(jìn)都能使PE系統(tǒng)發(fā)揮作用，拓展了PE系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。Xu等[32]在PE系統(tǒng)中加入HPT抗性基因構(gòu)建了pPE2、pPE3/3b，在水稻中對(duì)1個(gè)外源和3個(gè)內(nèi)源基因進(jìn)行小片段編輯，最高編輯效率達(dá)到31.3%，并將HPT-ATG回復(fù)突變加入到篩選過程中構(gòu)建了surrogate PE2系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠富集編輯細(xì)胞，不同程度提高編輯效率。另外，科研工作者還利用巧妙設(shè)計(jì)的報(bào)告系統(tǒng)富集編輯的細(xì)胞提高PE系統(tǒng)的編輯效率[33-34]。

3 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的應(yīng)用

由于PE系統(tǒng)強(qiáng)大的編輯功能及普適性，其一經(jīng)報(bào)道，便迅速在各種物種及各個(gè)研究領(lǐng)域進(jìn)行了應(yīng)用。下面詳細(xì)講述PE系統(tǒng)近期在動(dòng)物和植物中的推廣與應(yīng)用(表2)。

表2 PE系統(tǒng)的應(yīng)用

3.1 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在動(dòng)物中的應(yīng)用

目前PE系統(tǒng)在人和小鼠中的應(yīng)用較多。Anzalone等[11]利用優(yōu)化后PE3在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了24種單堿基編輯，其中包括12種堿基的轉(zhuǎn)換和顛換，平均編輯效率為(33±7.9)%。進(jìn)而，科研工作者又利用PE3進(jìn)行了小片段的插入和缺失編輯，1 bp和3 bp的插入效率分別為(32±9.8)%和(39±16)%；1 bp和3 bp的刪除效率分別為(29±14)%和(32±11)%。PE3還被用于模擬鐮刀型細(xì)胞貧血(AT-TA)、黑蒙性白癡(TATC插入)和朊病毒病(GC-TA)病因突變，并高效回復(fù)突變。并且，研究者還在K562、U2OS和Hela細(xì)胞及終端分化細(xì)胞原代小鼠皮層神經(jīng)元中應(yīng)用了PE3系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)均能成功編輯[11]。Sürün等[35]利用PE系統(tǒng)分別在HEK293T和hiPS細(xì)胞中進(jìn)行GFP到CFP的編輯，編輯效率分別為0.3%～6.5%和7.5%左右，比BE系統(tǒng)在HEK293T(13%～47%)和hiPS細(xì)胞(80%)中的編輯效率低很多。Schene等[36]利用PE系統(tǒng)在人小腸和肝類器官中實(shí)現(xiàn)模擬與癌細(xì)胞相關(guān)CTNNB1基因6個(gè)堿基的刪除，精確編輯效率為30%～50%，與2-D細(xì)胞水平的編輯效率相似。另外，該課題組還分別對(duì)DGAT1突變(第7外顯子3個(gè)堿基缺失c.629_631 delCCT)病人來源的小腸類器官和患威爾遜病(ATP7B一個(gè)堿基的重復(fù)c.1288 dup)病人來源的肝類器官進(jìn)行精確基因回復(fù)。與HDR相比，PE系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生更少的非必要插入缺失突變。Geurts等[37]在成體干細(xì)胞來源的結(jié)腸類器官和肝類器官中模擬了TP53的多種突變類型，其中在結(jié)腸類器官中的編輯效率最高為25%，在肝類器官中的最高達(dá)到97%。該課題組還比較了PE系統(tǒng)、ABE系統(tǒng)和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR三種編輯系統(tǒng)對(duì)CFTR-R785*突變的回復(fù)效率，結(jié)果顯示PE系統(tǒng)編輯效率為0～5.7%，ABE為9.1%，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR為1.22%。PE系統(tǒng)的編輯效率介于堿基編輯器和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR之間，但是對(duì)于不在BE系統(tǒng)editing window的突變，PE系統(tǒng)是相對(duì)較好的選擇。

Liu等[38]首次利用PE系統(tǒng)構(gòu)建了人類并指畸形的小鼠模型。人類并指畸形致病變異是基因HOXD13兩個(gè)堿基的顛換(G-C/G-T)。科研工作者在胚胎1-cell期顯微注射PE系統(tǒng)mRNA，在囊胚期兩種突變獲得效率分別為8/18(44%)和12/16(75%)；注射胚胎移植到代孕母親體內(nèi)獲得突變小鼠的效率分別為8/30(27%)和2/19(11%)。突變胚胎和小鼠的高通量測(cè)序結(jié)果顯示顯微注射會(huì)導(dǎo)致突變嵌合。Gao等[39]分別利用PE系統(tǒng)和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR制備CArG box突變小鼠，該位點(diǎn)位于Tspan2啟動(dòng)子內(nèi)，是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，獲得的小鼠在主動(dòng)脈和膀胱檢測(cè)不到Tspan2 mRNA的表達(dá)。PE系統(tǒng)和HDR獲得正確編輯小鼠的效率分別為26%和54%。研究者發(fā)現(xiàn)，11只HDR小鼠在靶位點(diǎn)都有不同程度的插入突變(0.91%～93.91%)，在10只PE鼠中沒有檢測(cè)到；在5只HDR鼠中檢測(cè)到不同程度的脫靶突變(5.5%～60.2%)，同樣在PE鼠中沒有檢測(cè)到高于對(duì)照鼠的突變。Liu等[18]通過尾靜脈注射方法在小鼠肝中對(duì)癌基因Ctnnb1進(jìn)行突變，注射PE2*的小鼠肝產(chǎn)生更多的腫瘤。另外，他們還用Split-Intein內(nèi)含肽介導(dǎo)分拆PE，并用AAV載體進(jìn)行遞送，成功對(duì)小鼠肝SERPINA1致病突變進(jìn)行精確回復(fù)。

PE系統(tǒng)還被應(yīng)用于其他模式動(dòng)物。Petri等[40]利用PE系統(tǒng)對(duì)斑馬魚的基因組進(jìn)行精確編輯，其中5 bp和10 bp刪除效率為4.13%～33.61%，小片段的精確插入效率高達(dá)18%。另外，作者還成功在斑馬魚中制備了兩個(gè)基因的致病變體TYR P301L和KRAS G12V，并通過生殖系傳遞給后代。Bosch等[41]在果蠅中也成功應(yīng)用了PE系統(tǒng)，經(jīng)檢測(cè)在S2R+細(xì)胞中，PE系統(tǒng)編輯效率約為4%～8%；通過轉(zhuǎn)基因雜交和胚胎注射也能有效編輯果蠅生殖細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因雜交獲得生殖系傳遞正確編輯效率最高為36%，胚胎注射為5.3%。研究表明，在大部分動(dòng)物基因組編輯過程中，PE3的編輯效率要高于PE2。

3.2 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用

Lin等[42]通過對(duì)PE系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化首次建立了適用于植物的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(plant prime editing，PPE)。PPE系統(tǒng)在水稻和小麥基因組中實(shí)現(xiàn)了12種單堿基替換(0.2%～8.0%)、多堿基替換(0.6%～1.5%)及小片段插入(1.1%)和缺失(4.3%)。研究結(jié)果顯示，編輯效率受RT模板長(zhǎng)度影響較大，在37 ℃條件下反應(yīng)效果最好，在非編輯鏈產(chǎn)生切口的策略對(duì)PPE系統(tǒng)效率影響不大。最后作者還構(gòu)建了二元載體，編輯效率高達(dá)21.8%。隨后，Tang等[43]對(duì)水稻的10個(gè)基因進(jìn)行靶向編輯，最高編輯效率達(dá)到1.55%。研究結(jié)果也表明，在非編輯鏈產(chǎn)生切口并不能提高PE系統(tǒng)在水稻中的編輯效率。Li等[44]成功在水稻中對(duì)外源hptII突變基因和內(nèi)源OsEPSPS基因?qū)崿F(xiàn)了精確編輯，其中外源基因的編輯效率為9.38%，內(nèi)源基因的編輯效率為2.22%。Butt等[45]利用PE系統(tǒng)對(duì)水稻的除草劑抗性基因OsALS、提高產(chǎn)量基因OsIPA和調(diào)控側(cè)枝基因OsTB1進(jìn)行了精確編輯。Hua等[46]利用Sp-PE2和Sp-PE3分別對(duì)水稻中轉(zhuǎn)基因的突變GFP和內(nèi)源基因ALS、APO1等進(jìn)行堿基替換、缺失和插入。突變GFP的回復(fù)編輯效率分別為15.6%和17.1%，內(nèi)源基因只有ALS的堿基替換效率為9.1%，其他內(nèi)源基因均檢測(cè)不到突變效率，可見PE系統(tǒng)對(duì)不同靶位點(diǎn)的作用情況不同。

科研工作者在其他植物中也陸續(xù)開展了PE系統(tǒng)的研究。Jiang等[47]通過增加PE中pegRNA表達(dá)框的數(shù)量及優(yōu)化pegRNA驅(qū)動(dòng)啟動(dòng)子提高pegRNA的表達(dá)量，首次對(duì)玉米兩個(gè)乙酰乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2進(jìn)行堿基替換(W542L和S621I)，編輯效率高達(dá)4.8%～53.2%，并且獲得ZmALS1和ZmALS2純合突變體。該研究的編輯效率較之前水稻中的研究有了很大的提升，為進(jìn)一步優(yōu)化植物PE系統(tǒng)提供了方向。Lu等[21]首次對(duì)雙子葉植物番茄GAI、ALS2和PDS1三個(gè)基因進(jìn)行了堿基替換、插入突變?？蒲泄ぷ髡哌€嘗試對(duì)馬鈴薯基因組進(jìn)行編輯，但是編輯效率非常低[48]。另外，PE系統(tǒng)也成功對(duì)擬南芥[49]、煙草[49]和小立碗蘚[48]等其他模式植物的基因組進(jìn)行了精確編輯。

4 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)設(shè)計(jì)工具

隨著PE系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，很多課題組研發(fā)了pegRNA的設(shè)計(jì)工具方便科研工作者應(yīng)用PE系統(tǒng)。Schene等[34]基于PBS序列設(shè)計(jì)和雙pegRNA策略，開發(fā)了植物pegRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站PlantPegDesigner(http://www.plantgenomeediting.net/)，為使用者提供了pegRNA選擇與推薦方案。Bhagwat等[50]開發(fā)了multicrispr工具，該工具可以針對(duì)包括PE系統(tǒng)等多種基于CRISPR的編輯方法進(jìn)行g(shù)RNA設(shè)計(jì)。Hsu等[51]針對(duì)prime editing系統(tǒng)合作開發(fā)了一項(xiàng)友好的網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)工具—PrimeDesign(http://primedesign.pinellolab.org/)，并利用此工具構(gòu)建了一個(gè)全面和可搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)—PrimeVar，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了對(duì)超過68 500種人類致病性遺傳變異的模擬和糾正的pegRNA和ngRNA組合。Chow等[52]開發(fā)了pegFinder(http://pegfinder.sidichenlab.org/)，為PE2和PE3設(shè)計(jì)pegRNA，并且報(bào)告中還給出不同長(zhǎng)度的RT模板和PBS序列供實(shí)驗(yàn)人員選擇。Morris等[53]對(duì)人類致病性疾病遺傳變異設(shè)計(jì)了模擬和糾正的PE系統(tǒng)，并通過Cas9替代酶和延長(zhǎng)RT模板策略，使覆蓋的致病變異達(dá)到了50 000以上，收集在以下網(wǎng)站(https://primeedit.nygenome.org/)。Hwang等[54]向PE系統(tǒng)應(yīng)用者提供了兩個(gè)免費(fèi)的網(wǎng)站PE-Designer(http://www.rgenome.net/pedesigner/)和PE-Analyzer(http://www.rgenome.net/pe-analyzer/)。PE-Designer可以進(jìn)行pegRNA的設(shè)計(jì)，包括目標(biāo)序列潛在的靶位點(diǎn)、pegRNA延伸序列及切口sgRNA的序列；PE-Analyzer專門用于PE結(jié)果分析，接受高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，能夠輸出突變分析的表格及作圖。

5 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

脫靶效應(yīng)一直是基因編輯工具比較關(guān)注的重點(diǎn)，為了檢測(cè)PE系統(tǒng)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，Jin等[55]率先在農(nóng)作物中深入評(píng)估了PPE系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)，PPE系統(tǒng)對(duì)間隔序列近PAM端及PBS的5′端的錯(cuò)配容忍度較低。通過對(duì)pegRNA的179個(gè)內(nèi)源潛在脫靶位點(diǎn)的編輯情況進(jìn)行高通量檢測(cè)，結(jié)果顯示PPE系統(tǒng)在水稻中的脫靶編輯效率很低(0～0.23%)，其中有8個(gè)位點(diǎn)攜帶一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配堿基，脫靶編輯效率僅為0～0.02%。研究人員還對(duì)依賴pegRNA和不依賴 pegRNA的全基因組范圍內(nèi)可能產(chǎn)生的堿基替換 (single nucleotide variants, SNVs) 和小片段的插入與缺失(insertions/deletions, Indels)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)PPE系統(tǒng)幾乎不會(huì)在基因組內(nèi)引發(fā)額外的SNVs或Indels突變。另外，在植物體中過表達(dá)PPE系統(tǒng)不會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄生物學(xué)過程，也不會(huì)在全基因組范圍內(nèi)產(chǎn)生pegRNA或mRNA序列的隨機(jī)插入[55]。以上結(jié)果表明PPE在植物中有很高的編輯特異性。

Kim等[56]利用nDigenome-seq在人的細(xì)胞中評(píng)估了PE系統(tǒng)的特異性，主要評(píng)估PE系統(tǒng)的主要組成nCas9的特異性，在9個(gè)靶位點(diǎn)中只檢測(cè)到5個(gè)脫靶位點(diǎn)，脫靶編輯效率為0.1%～0.9%，說明PE系統(tǒng)的特異性較高，并且通過應(yīng)用改造的Cas9變體會(huì)進(jìn)一步提高PE系統(tǒng)在人細(xì)胞中的編輯特異性。

6 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的發(fā)展前景

目前PE系統(tǒng)已在多個(gè)物種中進(jìn)行成功編輯，有廣泛的普適性。PE系統(tǒng)不產(chǎn)生DSB，通過引入編輯模板即可精確進(jìn)行小片段的插入/缺失及堿基間的任意替換，靶位點(diǎn)序列要求不嚴(yán)格，廣泛存在于基因組中。與BE系統(tǒng)相比，PE系統(tǒng)編輯效率雖然偏低，但是對(duì)于在BE系統(tǒng)編輯窗口(4～8 nt)存在多個(gè)可編輯堿基、編輯窗口之外及不可編輯類型(堿基顛換)的突變，PE系統(tǒng)是更好的選擇。與CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR相比，PE系統(tǒng)編輯效率相當(dāng)或優(yōu)于HDR，但是可大大減少由于HDR引入的插入突變，因此從整體水平上，PE系統(tǒng)是優(yōu)于HDR的。另外，多個(gè)物種的應(yīng)用顯示，PE系統(tǒng)的特異性高，脫靶效應(yīng)低，對(duì)于動(dòng)植物精準(zhǔn)育種和微突變引起的疾病治療等方面有很大的應(yīng)用潛力。

PE系統(tǒng)效率影響因素較多，不同物種的應(yīng)用效率不同，不同靶位點(diǎn)效率不同，另外，PBS和RT模板的長(zhǎng)度和反應(yīng)溫度也會(huì)影響PE系統(tǒng)的效率。因此，為了推進(jìn)PE系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，開發(fā)出針對(duì)不同物種的pegRNA設(shè)計(jì)及效率預(yù)測(cè)網(wǎng)站很有必要。目前，科研工作者在改造Cas9、擴(kuò)展PE系統(tǒng)編輯范圍、提高pegRNA穩(wěn)定性、載體遞送和篩選系統(tǒng)等方面對(duì)PE系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，都取得了很好的進(jìn)展。下一步，研究者可以考慮開展不同優(yōu)化方向協(xié)同作用的研究，更進(jìn)一步提高PE系統(tǒng)的編輯效率。PE系統(tǒng)在不同物種中的編輯效率差異較大，在動(dòng)物中的平均編輯效率比植物高，在馬鈴薯中尤其低。尋找不同物種中限制PE系統(tǒng)編輯效率的因素，進(jìn)一步優(yōu)化PE系統(tǒng)以適應(yīng)該物種的應(yīng)用，也是未來重要的研究方向。

自PE系統(tǒng)成功開發(fā)以來，科研工作者就從多個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，未來仍然可期?？傊?，PE系統(tǒng)在動(dòng)植物基因功能研究和育種方面有非常廣闊的前景，并且該技術(shù)有可能成為一種新的基因治療形式，以安全、高靶向的方式插入治療基因，以替代突變或缺失的基因。