李藝陽，殷詩舒，廖印長，徐 康，張躍博,3*，何 俊,3*

(1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410000；2.中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所 動物營養(yǎng)生理與代謝過程實驗室，長沙 410000；3.嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室，廣州 510000)

寧鄉(xiāng)豬是我國優(yōu)良的地方豬種之一，具有早熟易肥、適應性廣、肉質鮮美等特點，因而深受消費者喜愛[1-2]。有研究表明，肌內脂肪(IMF)含量是影響豬肉品質的重要因素之一[3-4]，與杜長大三元雜交商品豬相比，寧鄉(xiāng)豬IMF含量更高[5]，但由于未經(jīng)歷高強度選育，其變異也較大，十分不利于優(yōu)質豬肉的標準化生產(chǎn)。因此，鑒別影響寧鄉(xiāng)豬IMF含量的基因，并利用標記輔助選擇方法來穩(wěn)定和提升其IMF含量十分必要。本研究通過對IMF相關基因遺傳變異的綜合分析，以期篩選出影響寧鄉(xiāng)豬IMF含量的基因位點，為寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀的分子標記輔助選育提供科學依據(jù)。

脂肪酸結合蛋白(FABPs)是一類在哺乳動物組織中表達的胞漿蛋白，能夠結合脂肪酸和其他疏水性配體[6]。FABPs屬于細胞內類脂結合蛋白家族，參與細胞內長鏈脂肪酸的轉運，可將脂肪酸從細胞膜運送到脂肪酸氧化位點及其與甘油二酯及磷脂的合成位置[7]，研究發(fā)現(xiàn)FABPs能夠調節(jié)細胞內脂肪的合成和轉運[8]。豬的H-FABP基因5′UTR區(qū)和第二內含子處存在與IMF相關的多態(tài)性位點，是影響IMF含量的重要候選基因之一[9]。哺乳動物的A-FABP基因參與了甘油三酯的生成過程[10]，直接影響了IMF的含量，對脂肪代謝有重要的調控作用?；騿伪缎团c表型的關聯(lián)分析比SNP位點與表型的關聯(lián)分析更加準確，分析基因單倍型與性狀的相關性可以提高表型分析的準確性。另外，有研究指出，通過對不同豬種背最長肌差異表達基因的篩選，發(fā)現(xiàn)SLC13A5基因Bsu36 I多態(tài)性酶切位點(NC_010454.4:g.50705299T/C)以及NR1H4基因MwoI多態(tài)性酶切位點(NM_001206993:g.83607915G/A)均與IMF含量顯著相關[11-12]。本研究的目的在于檢測FABPs、SLC13A5和NR1H4基因在寧鄉(xiāng)豬上的多態(tài)性，為寧鄉(xiāng)豬育種工作提供有效分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中試驗動物來自寧鄉(xiāng)大龍豬場，選擇達到上市屠宰日齡的172頭寧鄉(xiāng)公豬。所有豬只均在相同的飼養(yǎng)管理條件下育肥至屠宰，屠宰前24 h禁食，提供自由飲水。屠宰后采集背最長肌樣品，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 DNA的提取

采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法提取組織DNA，測定DNA濃度，根據(jù)測定出的樣品濃度，用滅菌水稀釋DNA至20 ng·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 IMF含量的測定

試驗豬屠宰后立即采集左半側胴體腰椎處背最長肌約50 g，并參照文獻[13]采用索氏抽提法進行肌內脂肪提取。

1.4 引物設計合成與PCR擴增

根據(jù)GenBank注冊的X98558和Y16180序列，在H-FABP基因5′上游區(qū)和第二內含子區(qū)用Primer 5.0設計2對引物。從NCBI下載豬A-FABP基因組序列(GenBank登錄號：Y16039)設計引物。依據(jù)參考文獻[11-12]報道的序列設計SLC13A5和NR1H4基因的引物(表1)。所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5的引物序列

PCR擴增體系(25 μL)： Mix 12.5 μL，模板DNA 5 μL，上、下引物(10 μmol·L-1)各1 μL，滅菌蒸餾水5.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，要求目的條帶清晰、單一無雜帶，將符合條件的PCR產(chǎn)物進行酶切試驗。

1.5 基因分型

H-FABP應用限制性內切酶Hinf Ⅰ、HaeⅢ和MspⅠ進行PCR-RFLP分型。Hinf Ⅰ酶切體系(30 μL)：PCR擴增產(chǎn)物10 μL，Buffer 2 μL，限制性內切酶1 μL，滅菌蒸餾水17 μL；37 ℃反應5～15 min。HaeⅢ和MspI酶切體系(31 μL)：PCR擴增產(chǎn)物10 μL，Buffer 2 μL，限制性內切酶1 μL，滅菌蒸餾水18 μL；37 ℃反應1～16 h。酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。H-FABP基因酶切后等位基因的判定及酶切片段的長度見表2。A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因經(jīng)PCR擴增，獲得的良好產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果用DNAMAN系列軟件進行比對分析。

表2 H-FABP基因等位基因的判定及酶切片段的長度

1.6 統(tǒng)計分析

群體中的遺傳組成用基因型頻率和基因頻率表示。遺傳標記多態(tài)程度的常用指標有純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)等。PIC可以用來表示群體中某一位點多態(tài)性的程度，PIC>0.5為高度多態(tài)，PIC<0.25為低度多態(tài)，0.25

H-FABP基因的Hinf Ⅰ(SNP1)和HaeⅢ(SNP2)多態(tài)性位點間的連鎖不平衡分析采用Haploview軟件，采用R語言haplo.stats程序包進行單倍型種類及其頻率的分析。采用SPSS 26統(tǒng)計分析軟件的GLM(general linear model)程序分析不同基因型與IMF含量的相關性，統(tǒng)計模型為：

Y=μ+D+R+e

式中，Y為肌內脂肪含量測量值；μ為群體均值；D為體重效應；R為基因型效應；e為隨機殘差效應。

2 結 果

2.1 PCR產(chǎn)物擴增結果

擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(圖1)。結果顯示，擴增片段與目的片段大小一致且特異性較好，可直接進行RFLP或測序。

A. H-FABP基因706 bp的PCR產(chǎn)物；B. H-FABP基因816 bp的PCR產(chǎn)物；C. NR1H4基因761 bp的PCR產(chǎn)物；D. A-FABP基因783 bp的PCR產(chǎn)物；E. SLC13A5基因815 bp的PCR產(chǎn)物

2.2 H-FABP基因PCR-RFLP結果

在706 bp的擴增片段上存在4個Hinf Ⅰ酶切位點，產(chǎn)生339、172、110、59及26 bp共5個片段，其中第1 324 bp具有多態(tài)性，產(chǎn)生了HH、Hh、hh三種基因型；在816 bp擴增片段中存在3個HaeⅢ酶切位點，產(chǎn)生405、278、117及16 bp共4個片段，其中第1 811 bp處為多態(tài)性酶切位點，產(chǎn)生了DD和Dd兩種基因型；在816 bp擴增片段中存在1個MspⅠ酶切位點，產(chǎn)生727、89 bp兩個片段，僅檢測出AA一種基因型(圖2)。

A. H-FABP基因Hinf I酶切分型結果圖；B. H-FABP基因Hae III酶切分型結果；C. H-FABP基因Msp I酶切分型結果

2.3 A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因突變位點測序結果

通過DANMAN和Chromas軟件對寧鄉(xiāng)豬A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因PCR產(chǎn)物測序結果進行比對分析，結果見圖3。A-FABP基因測序結果顯示，A-FABP基因783 bp擴增片段中沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點；在SLC13A5基因815 bp擴增片段中發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(251 bp處)，存在3種基因型：BB型、Bb型和bb型；在NR1H4基因761 bp擴增片段中同樣發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(293 bp處)，測序結果顯示共發(fā)現(xiàn)了TT、Tt和tt三種基因型。

A.SLC13A5基因SNP測序峰圖；B.NR1H4基因SNP測序峰圖

2.4 寧鄉(xiāng)豬群體遺傳學分析

經(jīng)卡方適合性檢驗分析，Hinf Ⅰ-RFLP位點和NR1H4基因多態(tài)性位點上的等位基因頻率和基因型頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，HaeⅢ-RFLP位點、SLC13A5基因多態(tài)性位點經(jīng)卡方適合性檢驗，都未達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，可能與試驗群體數(shù)量少或近交程度有關。

從表3可以看出，H-FABP-Hinf Ⅰ酶切位點、SLC13A5和NR1H4基因多態(tài)性位點的純合度分別為0.62、0.54和0.62；多態(tài)信息含量分別為0.30、0.35和0.30，均屬中度多態(tài)(0.25

表3 寧鄉(xiāng)豬酶切位點多態(tài)性分析結果

2.5 寧鄉(xiāng)豬多態(tài)性位點不同基因型與IMF含量的關聯(lián)分析

寧鄉(xiāng)豬多態(tài)性位點與IMF含量的關聯(lián)分析結果見表4。寧鄉(xiāng)豬H-FABP基因Hinf Ⅰ位點酶切后3種基因型的IMF含量表現(xiàn)為Hh>HH>hh，其中Hh基因型與HH和hh基因型的IMF含量之間的差異達到極顯著水平(P<0.01)，HH基因型與hh基因型的IMF含量差異不顯著(P>0.05)。在HaeⅢ酶切位點上，只出現(xiàn)了DD和Dd兩種基因型，其中D等位基因占主導地位，Dd基因型IMF含量極顯著高于DD基因型(P<0.01)。

表4 寧鄉(xiāng)豬群不同位點各基因型IMF含量的比較

H-FABP基因MspⅠ酶切及A-FABP基因測序結果顯示寧鄉(xiāng)豬均不存在多態(tài)現(xiàn)象；SLC13A5基因多態(tài)性位點上檢測出的3種基因型在IMF含量上無顯著差異(P>0.05)，但呈現(xiàn)出bb>BB>Bb的趨勢；NR1H4基因多態(tài)性位點處3種基因型間的IMF含量差異也不顯著(P>0.05)。

2.6 寧鄉(xiāng)豬H-FABP基因單倍型組合與IMF含量的關聯(lián)分析

連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因SNP1和SNP2位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)(D′>0.72)。單倍型種類及其頻率分析表明，H-FABP基因的2個SNPs位點在寧鄉(xiāng)豬群體中共形成了3種單倍型(HD、hD和hd)，分別命名為H1、H2和H3，單倍型頻率分別為0.74、0.22和0.03。根據(jù)2個突變位點的連鎖不平衡結果，對H1～H3組成的每個個體的單倍型組合進行分析，共發(fā)現(xiàn)5種單倍型組合。

在形成的5種單倍型組合中，其中hD/hd單倍型組合樣本數(shù)為1，不進行關聯(lián)分析。用剩余4種單倍型組合與寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀進行關聯(lián)分析，結果見表5。H1H3(其序列為HD/hd)單倍型組合個體的IMF含量顯著高于H1H2(其序列為HD/hD)單倍型組合個體(P<0.05)，極顯著高于剩余兩種單倍型組合個體(P<0.01)。因此，在本試驗群體中H1H3單倍型組合個體具有最高的IMF含量。

表5 H-FABP基因單倍型組合及其與IMF含量性狀的關聯(lián)分析

3 討 論

大量研究表明，豬IMF含量受多個基因影響[15-18]。Ockner等[19]首次從腸組織液中分離出FABP，進一步研究發(fā)現(xiàn)FABP能特異性的結合脂肪酸，參與細胞內脂肪的運輸。在哺乳動物中FABPs家族至少有9種蛋白類型[20]。不同類型的FABP在不同的組織和細胞中表達，其中H-FABP在心肌、骨骼肌和乳腺中表達，A-FABP在脂肪細胞中表達[21]。本研究采用PCR-RFLP結合測序技術分析了寧鄉(xiāng)豬H-FABP和A-FABP基因的遺傳多態(tài)性，結果表明H和D為優(yōu)勢等位基因。寧鄉(xiāng)豬H-FABP-Hinf Ⅰ位點存在多態(tài)性，等位基因H的頻率為0.75，表現(xiàn)為中度多態(tài)(PIC=0.304 7)，與劉志成等[22]、張陳華等[23]及劉劍鋒等[24]在不同豬種中的研究結果基本一致。采用最小二乘效應分析表明，基因型Hh對IMF含量的效應值最大，該結果與王存芳[25]、Gerbens等[26]對杜洛克等國外豬種的分析結果有所差異，導致這一現(xiàn)象的原因可能與中外豬群體的遺傳背景不同有關。經(jīng)分析，H-FABP基因HaeⅢ酶切位點Dd基因型的IMF含量最高，并且未檢測到dd基因型，這與2003年柳小春等[27]報道的多態(tài)性結果一致，可能是由于dd基因型個體較少造成的，同時在一定程度上說明近20年來寧鄉(xiāng)豬保種效果良好。林萬華等[28-30]對國內外不同豬種HaeⅢ位點的多態(tài)性分析表明，不同豬種間多態(tài)性存在差異，等位基因頻率也各有不同。目前，在動物生產(chǎn)中單倍型分析得到越來越多的應用，與單個SNPs位點分析相比，利用單倍型研究QTL與動物生產(chǎn)性能間的相關性，能夠更準確的分析表型性狀的遺傳信息。房嘉園等[31]通過構建包含IGF-1R兩種單倍型的表達載體，發(fā)現(xiàn)大型豬和小型豬IGF-1R胞外域編碼區(qū)兩種單倍型在轉錄和翻譯水平上影響基因的表達，進而調控動物的生長發(fā)育。本研究對H-FABP基因的Hinf Ⅰ和HaeⅢ酶切位點進行單倍型分析，共形成3種單倍型、5種單倍型組合，其中H1H3是IMF含量性狀的優(yōu)勢單倍型。

在H-FABP-MspⅠ酶切位點上，所有被檢測個體的基因型均為AA型。黃大鵬等[32]、Pang等[14]對國內外不同豬種的分析結果表明，此位點上杜洛克豬、長白豬和大白豬3個國外豬種均存在多態(tài)性，而地方豬種內江豬、榮昌豬、漢江黑豬和八眉豬為單態(tài)。林萬華等[28]在杜洛克、長白、大約克、南昌白、二花臉、梅山、玉山黑豬等10個中外豬種上的研究結果也顯示，除杜洛克豬外其他豬種在此位點均無多態(tài)。根據(jù)之前的報道及研究結果可以認為，中國地方豬種在MspⅠ位點上缺乏多態(tài)性。

在A-FABP基因的Bsu36 Ⅰ酶切位點上，三江白豬、大白豬、東北民豬、長白豬和大河烏豬都存在多態(tài)性[32-35]，并且不同基因型間IMF含量存在顯著差異。本研究在此位點上僅檢測出一種基因型，可能原因是樣本數(shù)相對較少，其他基因型在群體中出現(xiàn)的頻率較低。目前，豬A-FABP基因的遺傳多態(tài)性研究相對較少。在松遼黑豬和軍牧1號白豬中，A-FABP基因遺傳多態(tài)性與大理石紋之間存在一定的相關性[36-37]。有研究指出，在杜洛克豬A-FABP基因第1內含子區(qū)發(fā)現(xiàn)的1條微衛(wèi)星序列，其多態(tài)性與IMF含量相關[38]。因此，利用該基因位點進行與寧鄉(xiāng)豬肉質相關性狀的選育有待更進一步的研究。

NR1H4基因在哺乳動物肌肉和脂質的能量代謝中起著重要的調節(jié)作用[38-39]，Yang等[40]利用PCR-RFLP技術在沙子嶺豬NR1H4基因的第9外顯子MwoI酶切位點處檢測到1個SNP，在產(chǎn)生的GG、GA和AA三種基因型中，G等位基因在沙子嶺豬中頻率較高，同時發(fā)現(xiàn)該基因在背肌的表達高于其他組織。本研究在NR1H4基因的SNP位點檢測到3種基因型，其中Tt基因型的IMF含量高于TT和tt基因型，但不同基因型對IMF含量的關聯(lián)均未達到顯著水平。Luo等[41]研究發(fā)現(xiàn)，豬SLC13A5基因Bsu36 I酶切位點多態(tài)性與IMF含量有顯著的關系，本研究對寧鄉(xiāng)豬SLC13A5基因的多態(tài)性進行研究，共檢測到3種基因型，其中bb型個體的IMF含量最高，但3種基因型間的IMF含量差異并不顯著(P>0.05)，與王玲玉[42]在大白豬中的研究結果一致。

4 結 論

對H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5基因在寧鄉(xiāng)豬群體中多態(tài)性的研究表明，H-FABP-MspⅠ和A-FABP-Bsu36 Ⅰ兩位點不存在多態(tài)現(xiàn)象；測序結果顯示，SLC13A5和NR1H4兩個多態(tài)性位點的不同基因型間IMF含量差異均不顯著，而H-FABP基因Hinf Ⅰ和HaeⅢ位點存在多態(tài)性，并與寧鄉(xiāng)豬IMF含量顯著關聯(lián)，其中這兩個位點形成的單倍型組合HD/hd的IMF含量最高。本研究結果可為寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀的分子標記輔助選育提供參考。