王騰飛，馮志強(qiáng)，孫雅雯，趙善江，郝海生，鄒惠影，杜衛(wèi)華，趙學(xué)明，朱化彬，龐云渭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞是成功受精和胚胎發(fā)育的重要基礎(chǔ)，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的任何異常都可能導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯和受精失敗。由于在減數(shù)分裂過(guò)程中卵母細(xì)胞缺乏轉(zhuǎn)錄活性，因此轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的調(diào)節(jié)對(duì)卵母細(xì)胞成熟至關(guān)重要[1]。特別是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)在卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過(guò)程中的多種細(xì)胞事件中起著關(guān)鍵作用，如DNA損傷應(yīng)答、染色體凝聚和細(xì)胞骨架組裝等[2]。O-β-N-乙酰葡糖胺(O-linked beta-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)修飾是一種與營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)激關(guān)系密切的PTM，它將單個(gè)的N-乙酰葡糖胺以β-構(gòu)型的O-糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上，是一種動(dòng)態(tài)、可逆的修飾[3]。O-GlcNAc修飾中的糖基供體二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)是己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthesis pathway, HBP)的終產(chǎn)物。O-GlcNAc的可逆修飾由O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)和相應(yīng)的糖苷酶(O-GlcNAcase, OGA)動(dòng)態(tài)調(diào)控，前者負(fù)責(zé)將糖基供體UDP-GlcNAc中的GlcNAc基團(tuán)添加到目標(biāo)蛋白的Ser/Thr羥基上，而后者能特異移除O-GlcNAc修飾蛋白上的GlcNAc[4]。

O-GlcNAc修飾影響蛋白質(zhì)空間構(gòu)象、活性和定位，廣泛參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝重塑、蛋白互作、免疫應(yīng)答等生理過(guò)程[5]。特別是，O-GlcNAc修飾在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、早期胚胎發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞多能性等方面發(fā)揮重要作用[6-8]。在牛和豬的IVM液中添加UDP-GlcNAc底物葡糖胺(glucosamine，GlcN)不會(huì)影響卵母細(xì)胞的核成熟，但卵母細(xì)胞受精后的囊胚發(fā)育率顯著降低[9]。在小鼠上，GlcN處理不僅會(huì)降低MII期卵母細(xì)胞比例，受精后胚胎的卵裂率和囊胚率也顯著減少[10-11]。采用OGA抑制劑破壞O-GlcNAc修飾的動(dòng)態(tài)平衡后，卵母細(xì)胞的O-GlcNAc水平顯著上調(diào)，盡管卵母細(xì)胞仍能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，但多精受精率顯著增加，最終導(dǎo)致受精卵發(fā)育異常[8]。上述研究表明，維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平的平衡對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。

由于O-GlcNAc修飾反映了細(xì)胞所處代謝環(huán)境，可作為一種營(yíng)養(yǎng)傳感器，為臨床醫(yī)學(xué)上治療糖尿病、肥胖和衰老等導(dǎo)致的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降提供新的靶點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)從作為感受微環(huán)境營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的O-GlcNAc修飾層面研究O-GlcNAc修飾變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟(invitromaturation, IVM)和發(fā)育能力的影響，并進(jìn)一步探究了O-GlcNAc修飾對(duì)OGT和OGA的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的牛卵巢均取自于河北省廊坊市大廠屠宰場(chǎng)，公牛冷凍精液購(gòu)自于山東奧克斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑及溶液配制

TCM199和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；無(wú)特殊說(shuō)明，其余試劑均購(gòu)自Sigma公司。

各溶液配制：IVM液：TCM199、0.01 IU·mL-1FSH、0.01 IU·mL-1LH、1 μg·mL-1E2、10 μg·mL-1肝素鈉、50 ng·mL-1EGF、100 ng·mL-1IGF、10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素；BO液：112 mmol·L-1NaCl、4.02 mmol·L-1KCl、2.25 mmol·L-1CaCl2·2H2O、0.52 mmol·L-1MgCl2·6H2O、0.83 mmol·L-1NaH2PO4、37 mmol·L-1NaHCO3、13.9 mmol·L-1葡萄糖、1.25 mmol·L-1丙酮酸鈉、3 mg·mL-1BSA；洗精液：40 mL BO液+135.32 mg咖啡因(10 mmol·L-1)；受精液：10 mL BO液+200 mg BSA+0.05 mL肝素鈉(20 μg·mL-1)+0.1 mL青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 μg·mL-1)；胚胎體外培養(yǎng)液mCR1aa：109.5 mmol·L-1NaCl、3.1 mmol·L-1KCl、26.2 mmol·L-1NaHCO3、0.8 mmol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mmol·L-1KH2PO4、0.4 mmol·L-1丙酮酸鈉、1.5 mmol·L-1葡萄糖、5 mmol·L-1半乳糖酸鈣、0.5% 酚紅、2% EAA(50×)、1% Non-EAA(100×)、15 mg·mL-1谷氨酰胺。

1.3 卵母細(xì)胞采集和體外成熟

從屠宰場(chǎng)收集卵巢，放入28～30 ℃含100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的滅菌生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用提前預(yù)熱30 ℃左右的滅菌生理鹽水將卵巢洗滌2～3遍，使用真空蠕動(dòng)泵抽取卵巢上直徑3～6 mm卵泡內(nèi)的卵泡液，在體式顯微鏡下?lián)斐雎亚?卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，分級(jí)并計(jì)數(shù)。

將挑選出的COCs用洗卵液洗2遍，再用IVM液洗3遍，之后移入在培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡2 h以上且覆蓋礦物油的四孔板中(每孔750 μL IVM液，培養(yǎng)50枚COCs)，IVM液中分別添加OGT抑制劑BADGP和OGA抑制劑PUGNAc，未添加組為對(duì)照。于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22～24 h。

1.4 體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)

將1支0.25 mL的冷凍精液在38 ℃的水浴鍋中解凍后，先加到含有2 mL洗精液(提前預(yù)熱)的15 mL離心管底部，之后再加入4 mL洗精液，用移液槍輕輕吹打混勻，1 800 r·min-1離心8 min；棄上清，重新加入6 mL洗精液，用移液槍輕輕吹打混勻，1 800 r·min-1離心8 min；棄上清，用洗精液重新懸浮精子沉淀。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算精子密度，調(diào)整精子密度為2×106個(gè)·mL-1。用移液槍吸取50 μL處理好的精子懸液加入到含有卵母細(xì)胞的受精微滴中，在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中精卵共孵育8～18 h。

將受精后的合子用0.1%的透明質(zhì)酸酶脫除卵母細(xì)胞表面的卵丘細(xì)胞后，用含6 mg·mL-1BSA的mCR1aa液洗3遍，移入培養(yǎng)微滴中(每滴20～30枚)進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄受精卵的卵裂率。之后移入含10% FBS的mCR1aa液中(每100 μL中20～30枚)，每2 d進(jìn)行半量換液，體外培養(yǎng)7～8 d后，觀察并記錄囊胚發(fā)育率。

卵裂率(%)=(卵裂數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù))×100；囊胚率(%)=(囊胚數(shù)/卵裂數(shù))×100。

1.5 免疫熒光染色

利用0.1%的透明質(zhì)酸酶對(duì)體外成熟培養(yǎng)22 h后的COCs進(jìn)行脫卵丘處理，然后利用終止液(TCM199 + 10% FBS)終止消化反應(yīng)。用0.1%PVA/DPBS洗3遍后，移入4%多聚甲醛(PFA)+ 0.5%TritonX-100液中，37 ℃固定通透45 min；再用0.1%PVA/DPBS洗3遍后，將卵母細(xì)胞置于1%BSA溶液中4 ℃封閉過(guò)夜。用含有0.02%Triton X-100的1%BSA溶液稀釋一抗(O-GlcNAc，Abcam，1∶500；TXNIP，Abcam，1∶500；OGT，Abcam，1∶500；OGA，Abcam，1∶500)并4 ℃孵育過(guò)夜，再用含有0.02%Triton X-100的1%BSA溶液稀釋二抗(Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG)，并室溫避光孵育1 h；洗3遍后采用DAPI壓片，在激光共聚焦顯微鏡下(TCS SP8, Leica，德國(guó))觀察染色情況并采集圖像。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)

采用NCBI設(shè)計(jì)引物序列，由華大基因公司合成引物序列(表1)。利用qRT-PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific)在CFX384TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))中進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系(10 μL)：上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，SYBR 5 μL，無(wú)RNA酶水3.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s；4 ℃ ∞。每個(gè)樣品重復(fù)3次，每組卵母細(xì)胞樣品為50枚。利用2ΔΔT法以GAPDH為內(nèi)參基因計(jì)算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物信息

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

收集各組卵母細(xì)胞樣品(每組50枚)，震蕩離心使其充分裂解。樣品在20 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清并與樣品緩沖液混合，100 ℃下煮沸變性。按照標(biāo)準(zhǔn)程序在4%～15%梯度SDS-PAGE凝膠上分離蛋白提取液，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%的脫脂奶粉稀釋1 h，阻斷印跡。然后，4 ℃條件下，在5%的脫脂奶粉稀釋的RL2中孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。ECL試劑盒顯色，將膜置于化學(xué)發(fā)光儀(Tanon，中國(guó)上海)中進(jìn)行曝光，拍照并保存。采用Image J軟件對(duì)Western blot蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-Way-ANOVA分析，用Duncan′s檢驗(yàn)判斷不同處理間的差異顯著性，P<0.05即認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 OGT、OGA及O-GlcNAc 蛋白在牛體外成熟卵母細(xì)胞中的分布

為了研究牛體外成熟卵母細(xì)胞中O-GlcNAc 修飾調(diào)節(jié)的亞細(xì)胞分布，首先使用OGT和OGA的特異性抗體分別對(duì)卵母細(xì)胞中OGT和O-GlcNAc蛋白及OGA和O-GlcNAc蛋白進(jìn)行免疫熒光共定位。結(jié)果顯示，OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖1)，而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且相對(duì)集中在卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)(圖2)。

紅色代表OGA蛋白；綠色代表O-GlcNAc蛋白；箭頭所指為皮質(zhì)區(qū)

2.2 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

將622枚卵母細(xì)胞(重復(fù)4次)分別在添加4 mmol·L-1BADGP和100 μmol·L-1PUGNAc的IVM液中進(jìn)行體外成熟，未添加組為對(duì)照組(control)，研究O-GlcNAc修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。如表2所示，與對(duì)照組相比(70.8%)相比，BADGP處理組(52.8%)和PUGNAc處理組(60.9%)均顯著降低了牛卵母細(xì)胞第一極體排出率(P<0.05)，但二者之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.3 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

將上述不同處理組體外成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，研究O-GlcNAc修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響。如表3所示，BADGP處理組(61.0%)和PUGNAc處理組(62.0%)的卵裂率與對(duì)照組(68.9%)相比差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組(21.5%)相比，BADGP處理組(9.6%)和PUGNAc處理組(10.0%)的囊胚率顯著降低(P<0.05)。

表3 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

2.4 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛體外成熟卵母細(xì)胞OGT和OGA表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)

為了研究O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛體外成熟卵母細(xì)胞中OGT和OGA表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，利用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)了不同處理組卵母細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平及OGT、OGA的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BADGP處理顯著抑制了OGT 的mRNA和蛋白表達(dá)(圖3B)，卵母細(xì)胞的O-GlcNAc修飾水平隨之顯著下調(diào)(圖3A)；OGA的mRNA和蛋白表達(dá)雖有所降低，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05；圖3C)。PUGNAc處理后，OGA 的mRNA和蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05；圖3C)，卵母細(xì)胞的O-GlcNAc修飾水平顯著升高(P<0.05；圖3A)；OGT的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而OGT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖3B)。進(jìn)一步對(duì)HBP的關(guān)鍵限速酶GFAT的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BADGP處理組GFATmRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而PUGNAc處理組GFATmRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05；圖3D)。

A. O-GlcNAc修飾水平；B. OGT mRNA和蛋白表達(dá)；C. OGA mRNA和蛋白的表達(dá)；D. GFAT mRNA的表達(dá)

2.5 O-GlcNAc 修飾水平變化對(duì)牛卵母細(xì)胞TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步檢測(cè)O-GlcNAc修飾水平變化對(duì)卵母細(xì)胞糖代謝的影響，檢測(cè)了不同處理組卵母細(xì)胞中糖代謝關(guān)鍵調(diào)控因子TXNIP 的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BADGP處理后，卵母細(xì)胞TXNIP mRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；而PUGNAc處理組卵母細(xì)胞的TXNIP mRNA和蛋白的表達(dá)雖有所升高，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05；圖4)。

A. TXNIP mRNA的表達(dá)；B. TXNIP 蛋白的表達(dá)

3 討 論

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和受精過(guò)程的代謝需求旺盛，因此，卵母細(xì)胞對(duì)發(fā)育微環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分的變化高度敏感。而O-GlcNAc修飾是哺乳動(dòng)物細(xì)胞重要的PTM之一，參與調(diào)節(jié)許多重要的生命活動(dòng)，可作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳感器調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在牛體外成熟卵母細(xì)胞中，OGT、OGA和O-GlcNAc蛋白存在不同的亞細(xì)胞定位，OGT和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而OGA和O-GlcNAc蛋白共定位于體外成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且相對(duì)集中在卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)，這與Zhou等[8]的研究結(jié)果部分一致。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠、牛和人卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中，OGT富集在減數(shù)分裂紡錘體上，而OGA在紡錘體的表達(dá)很低，主要富集在皮質(zhì)區(qū)[6,8]。OGT和OGA不同的亞細(xì)胞定位反映了二者在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中可能具有各自獨(dú)特的功能[13]。深入研究O-GlcNAc、OGT和OGA在減數(shù)分裂成熟過(guò)程中的精確功能將為揭示PTM對(duì)配子質(zhì)量的影響提供新的思路。

O-GlcNAc修飾及其相關(guān)酶在生物體的正常發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。敲除OGT會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)受限、細(xì)胞活力受損[14]。而OGT或OGA缺失會(huì)對(duì)小鼠造成致命損傷[15-17]。事實(shí)上，OGT和OGA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，破壞O-GlcNAc修飾平衡會(huì)延遲卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟進(jìn)程[19]，后續(xù)的報(bào)道也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論[20-21]。然而，在牛上的研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc修飾的改變不影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程，但會(huì)影響精子頭解聚及導(dǎo)致多精受精，進(jìn)而造成早期胚胎發(fā)育受損[8]。在本研究中，成熟培養(yǎng)液中添加OGT或OGA的抑制劑顯著降低了牛卵母細(xì)胞體外成熟率和受精后的囊胚發(fā)育率，與上述研究結(jié)果一致。這表明，維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾平衡對(duì)卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。

OGT和OGA是添加和移除O-GlcNAc修飾基團(tuán)、維持O-GlcNAc修飾動(dòng)態(tài)平衡的唯一一對(duì)酶，二者實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)數(shù)千種O-GlcNAc修飾蛋白的精密調(diào)控[3,22-23]。一些研究發(fā)現(xiàn)，OGT和OGA的表達(dá)對(duì)胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平的變化頗為敏感[24-27]。利用OGA抑制劑來(lái)提高胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平會(huì)導(dǎo)致OGT蛋白表達(dá)減少，OGA蛋白表達(dá)增加[24-26]。而采用OGT抑制劑或GFAT抑制劑降低O-GlcNAc修飾水平時(shí)，胞內(nèi)OGT蛋白表達(dá)增多，OGA蛋白表達(dá)減少[26-27]。以上結(jié)果表明，機(jī)體通過(guò)反饋調(diào)節(jié)OGT和OGA的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)O-GlcNAc修飾水平的波動(dòng)，進(jìn)而維持細(xì)胞O-GlcNAc修飾的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本研究檢測(cè)不同處理組OGT和OGA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OGT抑制劑BADGP處理顯著降低了OGT 的表達(dá)，卵母細(xì)胞的O-GlcNAc修飾水平發(fā)生下調(diào)，OGA 的表達(dá)降低；在OGA抑制劑PUGNAc處理組中，卵母細(xì)胞OGA 的表達(dá)顯著下調(diào)，O-GlcNAc修飾水平升高，OGT的蛋白表達(dá)顯著減少。本研究以卵母細(xì)胞為對(duì)象，得到的結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道存在一定的差異，說(shuō)明生殖細(xì)胞的反饋調(diào)節(jié)可能有別于體細(xì)胞。

HBP是葡萄糖代謝途徑之一，生物機(jī)體利用碳水化合物(葡萄糖)、氨基酸(谷氨酰胺)、脂質(zhì)(乙酰輔酶A)和核苷酸(尿苷)等4種主要大分子經(jīng)HBP代謝最終生成UDP-GlcNAc，UDP-GlcNAc是O-GlcNAc修飾的糖基供體[28]。而GFAT是HBP的關(guān)鍵限速酶。研究發(fā)現(xiàn)，GFAT的表達(dá)和活性受UDP-GlcNAc的反饋抑制調(diào)節(jié)，在糖尿病和一系列癌癥類型中均發(fā)現(xiàn)GFAT的異常表達(dá)[29-31]。實(shí)際上，GFAT、OGT和OGA均參與O-GlcNAc修飾內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[32]。與野生型相比，敲除OGT的線蟲(chóng)模型GFAT的mRNA水平顯著升高[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc修飾水平的變化與GFATmRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制OGT顯著上調(diào)了GFATmRNA的表達(dá)，而抑制OGA顯著下調(diào)了GFATmRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，HBP途徑對(duì)O-GlcNAc修飾水平的變化可能存在一種補(bǔ)償機(jī)制，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)GFAT表達(dá)應(yīng)對(duì)GlcNAc修飾水平的波動(dòng)，進(jìn)而維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，O-GlcNAc修飾水平的變化對(duì)GFAT活性的影響及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是參與葡萄糖代謝的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。本實(shí)驗(yàn)室前期利用RNA干擾技術(shù)降低TXNIP表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的葡萄糖攝取能力增強(qiáng)，卵母細(xì)胞成熟得到改善[34]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HBP的變化能夠調(diào)控TXNIP的表達(dá)[35-36]。Filhoulaud等[37]報(bào)道，高糖誘導(dǎo)下，胰島β細(xì)胞發(fā)生TXNIP的O-GlcNAc修飾，發(fā)生O-GlcNAc修飾的TXNIP通過(guò)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β的分泌，調(diào)節(jié)炎性小體的激活。以上研究提示，O-GlcNAc修飾環(huán)境與TXNIP活性調(diào)節(jié)可能存在一定的關(guān)系。在本研究中，采用OGT或OGA抑制劑改變卵母細(xì)胞的O-GlcNAc修飾水平，發(fā)現(xiàn)TXNIP 的表達(dá)均上調(diào)，表明O-GlcNAc修飾的改變可能影響了卵母細(xì)胞的糖攝取和糖代謝。然而，O-GlcNAc修飾對(duì)卵母細(xì)胞TXNIP活性的分子調(diào)控機(jī)制還需深入探究。

4 結(jié) 論

維持胞內(nèi)O-GlcNAc修飾的平衡對(duì)卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。成熟培養(yǎng)液中添加OGT或OGA的抑制劑顯著降低了牛卵母細(xì)胞體外成熟率和受精后的囊胚發(fā)育率，卵母細(xì)胞通過(guò)反饋調(diào)節(jié)OGT、OGA和GFAT的表達(dá)，以及上調(diào)葡萄糖調(diào)控關(guān)鍵因子TXNIP的表達(dá)應(yīng)對(duì)O-GlcNAc修飾水平的波動(dòng)。研究結(jié)果對(duì)研究哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞代謝異常和改善卵母細(xì)胞質(zhì)量具有參考意義。