王家敏，李自良，馬芳芳，康碧靜，田 玲，李 倬，馬忠仁，喬自林

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730030；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的急性傳染病，最早發(fā)生于美國，1902年，由匈牙利學(xué)者Aujeszky成功分離到偽狂犬病病毒，在歐洲、美洲、非洲及亞洲都有發(fā)病報(bào)道[1-2]。近年來，PR在我國持續(xù)流行，給畜牧業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2017年，我國發(fā)現(xiàn)了PRV變異毒株感染人的確診病例，基因測序顯示與近年流行的變異毒株高度同源，具有較高的人畜共患、跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)。研發(fā)生產(chǎn)周期短、過程控制能力強(qiáng)的PR疫苗生產(chǎn)工藝勢在必行[1-5]。目前國內(nèi)主要以原代雞胚細(xì)胞、傳代ST和BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)PR疫苗，但由于該工藝需要消耗大量的動(dòng)物血清、細(xì)胞培養(yǎng)容器以及勞動(dòng)力，特別是當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)具有局限性[6]。開發(fā)無血清懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)勢突出，BHK-21懸浮細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)、生長速率快、PRV敏感，是目前研發(fā)PR疫苗的優(yōu)選細(xì)胞株。懸浮細(xì)胞更容易利用生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)線性放大培養(yǎng)，且無血清培養(yǎng)基的使用使疫苗產(chǎn)品具有更好的穩(wěn)定性和安全性，完全擺脫對血清的依賴，降低生產(chǎn)成本[7-9]。因此，研發(fā)BHK-21懸浮細(xì)胞無血清培養(yǎng)生產(chǎn)PR疫苗工藝具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

BHK-21貼壁細(xì)胞：由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心先后從ATCC、生產(chǎn)企業(yè)引進(jìn)3株BHK-21貼壁細(xì)胞，本研究中分別標(biāo)記為BHK-21-01、BHK-21-02、BHK-21-03細(xì)胞；用含10%FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

BHK-21懸浮細(xì)胞：由本課題組自主馴化、凍存3株全懸浮細(xì)胞，分別命名為BHK-21-XF01、BHK-21-XF02、BHK-21-XF03細(xì)胞；可用SFM-BHK無血清培養(yǎng)基或含3%NBS的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

疫苗生產(chǎn)用偽狂犬病病毒：弱毒Bartha-K61株，為gE和gI基因缺失株，購自山東華宏生物工程有限公司。

1.2 主要試劑與設(shè)備

MEM培養(yǎng)基、SLM-BHK低血清培養(yǎng)基、SFM-BHK無血清培養(yǎng)基和PBS購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司。新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司。0.25%胰蛋白酶購自Gibco。0.2%臺(tái)盼藍(lán)購自Sigma。二甲基亞砜購自Thermo Scientific。

CKX-41型生微倒置顯微鏡購自O(shè)lympus。3111型CO2培養(yǎng)箱購自ThermoFisher。IC1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自Countstar。ZCZY-AS8型震蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。DASGIP四聯(lián)平行生物反應(yīng)器、BioFlo 320型生物反應(yīng)器購自Eppendorf。

1.3 BHK-21細(xì)胞對PRV敏感性研究

在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以1∶4比例傳代BHK-21-01、BHK-21-02、BHK-21-03貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80%～90%單層時(shí)，按病毒感染復(fù)數(shù)(MOI) 0.01接種PRV，每株細(xì)胞平行3組，另設(shè)1組空白對照，置于37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)。

在125 mL搖瓶中，以5.0×105cells·mL-1初始密度接種BHK-21-XF01、BHK-21-XF02、BHK-21-XF03懸浮細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到6.0×106cells·mL-1以上時(shí)，稀釋至3.0×106cells ·mL-1，按照MOI=0.01接種PRV，每株細(xì)胞平行3組，另設(shè)1組空白對照，置于37 ℃、5% CO2、120 r·min-1懸浮培養(yǎng)。

BHK-21貼壁和懸浮細(xì)胞接種PRV后，在24、48、72 h取樣測定細(xì)胞活率和半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)，觀察細(xì)胞形態(tài)和病變程度[10]。

1.4 BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞生長特性分析

BHK-21-XF02細(xì)胞在含3% NBS的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基和SFM-BHK無血清中連續(xù)培養(yǎng)3代后，分別以不同初始密度接種至搖瓶，置于37 ℃、5% CO2、120 r·min-1懸浮培養(yǎng)，每個(gè)接種密度平行3組，每12 h取樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。比較不同初始接種密度培養(yǎng)BHK-21-XF02細(xì)胞的最大增殖密度、倍增時(shí)間和比生長速率。兩種培養(yǎng)基中，待細(xì)胞密度達(dá)到6.0×106cells·mL-1以上時(shí)，稀釋至3.0×106cells·mL-1，然后分別按MOI=0.01接種PRV，平行3組，置于37 ℃、5% CO2、120 r·min-1培養(yǎng)。病毒接種24、48、72 h取樣測定TCID50[11-13]。

倍增時(shí)間=T/A，A=log2(Y/X)

(1)

式(1)中：X為初始接種細(xì)胞數(shù)，Y為細(xì)胞最大增殖密度前一天的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時(shí)間。

比生長速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

(2)

式(2)中：X為活細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時(shí)間，n和n-1為2個(gè)取樣計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn)。

1.5 生物反應(yīng)器BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化

在1.2 L DASGIP四聯(lián)平行生物反應(yīng)器中，利用響應(yīng)面法探究無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞初始接種密度、攪拌轉(zhuǎn)速和溶氧三個(gè)自變量對BHK-21-XF02細(xì)胞增殖密度的影響。Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)每個(gè)變量分為三個(gè)水平(-1為最小值，1為最大值，0為中心點(diǎn))，三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。根據(jù)1.2 L生物反應(yīng)器優(yōu)化得到的最優(yōu)培養(yǎng)參數(shù)，將BHK-21-XF02細(xì)胞接種于5 L生物反應(yīng)器，進(jìn)行批培養(yǎng)驗(yàn)證，每12 h取樣測定細(xì)胞密度和活率，連續(xù)培養(yǎng)72 h，繪制細(xì)胞生長曲線[14-15]。

表1 三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6 生物反應(yīng)器PRV增殖條件優(yōu)化

在1.2 L DASGIP四聯(lián)平行生物反應(yīng)器中，按照表2，分別以不同MOI、細(xì)胞密度、培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速條件，接種PRV，病毒接種24、48、72 h取樣測定TCID50[16-17]。

表2 生物反應(yīng)器中PRV增殖條件

根據(jù)響應(yīng)面法確定的細(xì)胞培養(yǎng)最佳條件和單因素試驗(yàn)確定的病毒增殖最佳條件，擴(kuò)大培養(yǎng)至5 L生物反應(yīng)器，接種病毒，連續(xù)培養(yǎng)至72 h，每24 h取樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，并測定TCID50[15]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 BHK-21細(xì)胞PRV敏感性研究

BHK-21-01、BHK-21-02、BHK-21-03三株貼壁細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)形態(tài)有差異，BHK-21-01、BHK-21-02細(xì)胞長勢優(yōu)于BHK-21-03細(xì)胞。接種PRV后24 h，BHK-21-02細(xì)胞出現(xiàn)少量細(xì)胞圓縮，產(chǎn)生輕微CPE，而BHK-21-01、BHK-21-03細(xì)胞未見明顯CPE；48 h，BHK-21-02細(xì)胞出現(xiàn)大量細(xì)胞圓縮，產(chǎn)生明顯CPE，BHK-21-01、BHK-21-03細(xì)胞有輕微CPE產(chǎn)生；72 h，BHK-21-02細(xì)胞幾乎所有細(xì)胞圓縮、破碎，CPE完全，TCID50為(4.67±0.09)lgTCID50·mL-1(P<0.05)，BHK-21-01、BHK-21-03細(xì)胞有明顯CPE產(chǎn)生，TCID50分別為(4.20±0.13) lgTCID50·mL-1、(2.09±0.17)lgTCID50·mL-1(P<0.05)；BHK-21-02細(xì)胞最敏感，作為后續(xù)TCID50病毒滴度檢測細(xì)胞(圖1、3)。

BHK-21-XF01、BHK-21-XF02、BHK-21-XF03三株懸浮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)形態(tài)無差異，細(xì)胞圓亮、邊緣整齊，大小均一。接種PRV后24 h，細(xì)胞發(fā)生明顯CPE；48 h，細(xì)胞直徑變大，開始崩解；72 h，細(xì)胞大量崩解、出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，TCID50分別為(3.35±0.17)、(4.05±0.11)、(3.07±0.18)lgTCID50·mL-1(P>0.05)，BHK-21-XF02細(xì)胞最敏感，用于后續(xù)研究(圖2、3)。

A1. BHK-21-01細(xì)胞；A2. BHK-21-01接毒后72 h；B1. BHK-21-02細(xì)胞；B2. BHK-21-02接毒后72 h；C1. BHK-21-03細(xì)胞；C2. BHK-21-03接毒后72 h

A1、A2. BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞；B1、B2. 24 h；C1、C2. 48 h；D1、D2. 72 h；1. 未染色；2. 臺(tái)盼藍(lán)染色

A. BHK-21貼壁細(xì)胞；B. BHK-21懸浮細(xì)胞

2.2 BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞生長特性分析

搖瓶中，BHK-21-XF02細(xì)胞在含3% NBS的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基和SFM-BHK無血清中連續(xù)傳代培養(yǎng)3代后，分別以0.3×106、0.6×106、0.9×106、1.2×106、1.5×106cells·mL-1的密度接種培養(yǎng)，生長曲線均呈近“S”型(圖4)。

在含3%NBS的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基中，不同接種密度細(xì)胞的最大增殖密度分別為(12.59±1.28)×106、(15.69±1.47)×106、(18.13±0.68)×106、(17.21±1.48)×106、(18.09±0.86)×106cells·mL-1，差異顯著(P<0.05)；倍增時(shí)間分別為(19.03±0.49)、(22.13±0.67)、(23.51±0.78)、(25.68±0.89)、(24.45±0.63) h(圖5)；不同密度接種培養(yǎng)BHK-21-XF02細(xì)胞的倍增時(shí)間隨著接種密度的增大逐漸增加，比生長速率均在36 h時(shí)達(dá)到最大比生長速率，最大比生長速分別為(0.059±0.016)、(0.063±0.020)、(0.067±0.010)、(0.058±0.018)、(0.052±0.016) h-1，隨后比生長速率迅速下降，差異顯著(P<0.05)(圖6)。

在SFM-BHK無血清中，不同接種密度細(xì)胞的最大增殖密度分別為(7.34±0.25)×106、(8.14±0.47)×106、(8.95±0.47)×106、(8.81±0.44)×106、(8.72±0.44)×106cells·mL-1，0.3×106與0.6×106cells·mL-1組差異不顯著(P>0.05)，與其他組差異顯著(P<0.05)；倍增時(shí)間分別為(21.71±0.61)、(23.15±0.70)、(26.06±0.74)、(30.66±0.82)、(33.56±0.60)h(如圖4)。比生長速率BHK21-XF02懸浮細(xì)胞均在36 h時(shí)達(dá)到最大比生長速率，最大比生長速分別為(0.054±0.006)、(0.051±0.009)、(0.055±0.008)、(0.055±0.007)、(0.042±0.014) h-1，隨后比生長速率迅速下降，差異顯著(P<0.05)(圖6)。

A1、A2. 低血清培養(yǎng)基；B1、B2. 無血清培養(yǎng)基

A1、A2. 低血清培養(yǎng)基；B1、B2. 無血清培養(yǎng)基; NS.P>0.05, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001, ****.P<0.000 1

A1、A2. 低血清培養(yǎng)基；B1、B2. 無血清培養(yǎng)基; **.P<0.01, ***.P<0.001, ****.P<0.000 1

BHK-21-XF02細(xì)胞接種PRV，相比于含3% NBS的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基，SFM-BHK無血清培養(yǎng)基中病毒增殖效果較好，差異顯著(P=0.023 7)，培養(yǎng)至24 h病毒滴度為(2.28±0.07) lgTCID50·mL-1，48 h為(4.89±0.20) lgTCID50·mL-1，72 h為(3.47±0.20) lgTCID50·mL-1(圖7)，故選擇SFM-BHK無血清培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)器條件優(yōu)化。

*.P=0.023 7

2.3 生物反應(yīng)器BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，對中心點(diǎn)重復(fù)了5組試驗(yàn)(如表3)。每24 h取樣計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)至72 h的細(xì)胞增殖密度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)三個(gè)變量對培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響。根據(jù)17組試驗(yàn)的結(jié)果，使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到了1.2 L反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21懸浮細(xì)胞增殖密度與三個(gè)變量之間關(guān)系的二次多項(xiàng)回歸方程(3)：

表3 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

細(xì)胞密度(cells·mL-1)=726.20+72.38×A-18.62×B+ 6.50×C+31.00×A×B-40.75×A×C-74.25×B×C+14.90×A2-55.10×B2-81.85×C2

(3)

通過對該多元二次模型進(jìn)行F檢驗(yàn)和方差分析(ANOVA)(見表4)，本試驗(yàn)建立的多元二次模型具有顯著性(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)差異不顯著(P=0.130 9>0.05)，說明未知因素對試驗(yàn)的結(jié)果干擾小。決定系數(shù)R2=0.983 3，校正決定系數(shù)為R2Adj=0.961 9，建立的二次多項(xiàng)模型能解釋96.19%的響應(yīng)值變化，結(jié)果表明該模型的擬合度良好，用此模型對1.2 L反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21-XF02細(xì)胞增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。

表4 多元二次模型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對回歸方程的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)中A、B、AB、AC、BC、B2、C2對BHK-21-XF02細(xì)胞增殖密度影響顯著(P<0.05)，在1.2 L反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21-XF02細(xì)胞增殖的過程中，接種密度和攪拌轉(zhuǎn)速對細(xì)胞增殖具有顯著的影響，而且三個(gè)因素(AB、AC、BC)交互作用也會(huì)對細(xì)胞增殖造成顯著影響。

通過多元二次模型方程的建立得到了3個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面3D圖(圖8)，從動(dòng)態(tài)圖和等高線的形狀可以看出攪拌轉(zhuǎn)速與接種密度對BHK-21-XF02細(xì)胞增殖密度的交互作用的影響顯著(P<0.05)，細(xì)胞增殖密度隨著接種密度和攪拌轉(zhuǎn)速的升高而增加；將溶氧固定在0水平時(shí)，細(xì)胞增殖密度伴隨著接種密度和攪拌轉(zhuǎn)速的升高而增加；當(dāng)接種密度和攪拌轉(zhuǎn)速過高時(shí)細(xì)胞增殖密度呈下降趨勢；低接種密度和(低攪拌轉(zhuǎn)速/高攪拌轉(zhuǎn)速)均不利于細(xì)胞增殖。溶氧與接種密度對細(xì)胞增殖密度的交互作用的影響極顯著(P<0.000 1)，等高線呈橢圓形，細(xì)胞增殖密度與接種密度呈正相關(guān)，連續(xù)培養(yǎng)至72 h，細(xì)胞增殖密度達(dá)到7.69×106cells·mL-1。溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速對細(xì)胞增殖密度的交互作用的影響顯著(P<0.05)。從圖8可以看出當(dāng)溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速過低時(shí)，在培養(yǎng)過程中對細(xì)胞增殖影響較大，連續(xù)培養(yǎng)至72 h，細(xì)胞增殖密度僅僅為5.10×106cells·mL-1，低溶氧和低攪拌轉(zhuǎn)速會(huì)造成細(xì)胞增殖速率下降。

根據(jù)所建立的模型及試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析得到了1.2 L反應(yīng)器培養(yǎng)BHK-21-XF02細(xì)胞增殖的最佳培養(yǎng)條件：接種密度為1.20×106cells·mL-1、攪拌轉(zhuǎn)速為120.97 r·min-1、DO值為39.36%，在此條件下細(xì)胞增殖密度理論值為8.22×106cells·mL-1。在反應(yīng)器中實(shí)際設(shè)定值分別為接種密度為1.20×106cells·mL-1、攪拌轉(zhuǎn)速為120 r·min-1、DO值為40%，1.2 L反應(yīng)器中進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，連續(xù)培養(yǎng)至72 h，細(xì)胞增殖密度為(7.75±0.27)×106cells·mL-1、細(xì)胞活率為95.43%；相比于預(yù)測理論值誤差為0.47×106cells·mL-1，符合度為94.26%。

按1.2 L反應(yīng)器優(yōu)化得到的培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行5 L反應(yīng)器擴(kuò)大批培養(yǎng)，細(xì)胞生長曲線和活率如圖8d所示，從圖中可以看出生長曲線近成“S”型，培養(yǎng)至72 h時(shí)細(xì)胞密度為(7.61±0.18)×106cells·mL-1、細(xì)胞活率為(96.93±1.18)%，在線性放大過程中，BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)較穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)了5 L生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)。

a.接種密度與攪拌轉(zhuǎn)速；b.接種密度與溶氧；c.溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速；d.5 L反應(yīng)器生長曲線

2.4 生物反應(yīng)器PRV增殖條件優(yōu)化

利用單因素分析法在1.2 L反應(yīng)器中優(yōu)化PRV增殖條件，結(jié)果顯示(圖9)按MOI=0.001接種PRV增殖效果更好，24、48、72 h病毒滴度TCID50分別為(2.77±0.23)、(5.45±0.051)、(4.21±0.11) lgTCID50·mL-1(P<0.05)。按2×106cells·mL-1細(xì)胞密度接種病毒更有利于病毒的增殖，24、48、72 h病毒滴度TCID50分別為(3.80±0.27)、(6.34±0.15)、(6.0±0.10)lgTCID50·mL-1(P<0.05)。病毒增殖的最適溫度為(37.0±0.5)℃，培養(yǎng)至24、48、72 h病毒滴度TCID50分別為(4.06±0.18)、(6.27±0.16)、(6.01±0.19)lgTCID50·mL-1(P<0.05)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120、80 r·min-1時(shí)病毒增殖效果較好，但在80 r·min-1時(shí)培養(yǎng)效果最佳，24、48、72 h病毒滴度TCID50分別為(4.52±0.38)、(7.06±0.17)、(6.38±0.15)lgTCID50·mL-1(P<0.05)。

A.MOI；B.細(xì)胞濃度；C.攪拌轉(zhuǎn)速；D.溫度；*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001, ****.P<0.000 1

按1.2 L生物反應(yīng)器優(yōu)化得到的病毒增殖參數(shù)，進(jìn)行5 L生物反應(yīng)器擴(kuò)大批培養(yǎng)，接毒后連續(xù)培養(yǎng)至72 h，每12 h取樣測定細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，細(xì)胞生長曲線和活率曲線見圖10A，培養(yǎng)至12 h時(shí)細(xì)胞快速增殖、24 h時(shí)病毒開始增殖，抑制了細(xì)胞的增殖，細(xì)胞密度和細(xì)胞活率逐步下降，48 h時(shí)病毒大量擴(kuò)增，細(xì)胞密度和細(xì)胞活率分別為(2.96±0.17)×106cells·mL-1、(66.69±6.66)%，72 h時(shí)細(xì)胞密度和細(xì)胞活率分別為(2.19±0.17)×106cells·mL-1、(20.58±7.23)%(P<0.05)；接種病毒后培養(yǎng)至24 h后，每12 h取樣檢測病毒滴度，病毒滴度TCID50見圖10B，接種病毒后24～72 h病毒滴度先升高后下降，48 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最大值(7.13±0.11)lgTCID50·mL-1(P<0.05)。

A. 接毒后細(xì)胞生長曲線；B. TCID50；**.P<0.01, ***.P<0.001, ****.P<0.000 1

3 討 論

PRV在世界各地豬場流行已有近百年，給許多國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。20世紀(jì)90年代以來，一些歐美國家如英國、丹麥、荷蘭、美國等利用gE基因缺失的PRV制備疫苗，大規(guī)模免疫動(dòng)物并淘汰感染動(dòng)物，已經(jīng)消滅了PR。但是，對于部分發(fā)展中國家和地區(qū)，豬PR仍是動(dòng)物傳染病中危害最嚴(yán)重的疾病之一[1]。我國也在1974年引進(jìn)gE基因缺失PRV疫苗，經(jīng)過相關(guān)部門的安全性和有效性評(píng)價(jià)后，在雞胚、豬腎和雞胚原代細(xì)胞系中生產(chǎn)并應(yīng)用，使得PRV一度得到了良好的控制。2011年底以后，包括PR疫苗免疫合格豬場陸續(xù)發(fā)生PRV變異株的感染疫情，迅速擴(kuò)大至數(shù)省并席卷全國，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1947年，我國學(xué)者劉永純等首次分離得到PRV，隨后在牛和豬群中相繼發(fā)現(xiàn)該病毒。近年來，我國學(xué)者大量分離獲得野生PRV，調(diào)查顯示，23個(gè)地區(qū)有80.1%的農(nóng)場受變異PRV的影響，導(dǎo)致部分疫苗不能提供有效的完整保護(hù)。PRV出現(xiàn)了大范圍的跨種傳播現(xiàn)象，尤其2018年和2020年，我國學(xué)者分別報(bào)道了兩例PRV變異毒株感染人的確診病例，引起了研究人員的重視[5,18]。因此，適用于我國PR疫情防控的疫苗生產(chǎn)用毒株和高產(chǎn)能PR疫苗生產(chǎn)工藝的開發(fā)是解決現(xiàn)狀的重要課題。

生物反應(yīng)器無血清全懸浮培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)工藝具有極大優(yōu)勢，Bissinger等[12]開發(fā)MDCK懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗工藝，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞高密度培養(yǎng)和病毒的高效增殖。Petiot等[10]首次建立了DuckCelt?-T17懸浮細(xì)胞系，進(jìn)行了禽流感病毒增殖條件研究。另外，CHO-K1、HEK-293、SF9等細(xì)胞也實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，廣泛用于抗體藥物、病毒載體疫苗的生產(chǎn)，國際上生物反應(yīng)器CHO-K1懸浮培養(yǎng)最大規(guī)?？蛇_(dá)25 000 L，我國反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)規(guī)模與發(fā)達(dá)國家還存在一定差距[15-16, 19]。Nie等[20]探索了利用固定床生物反應(yīng)器片狀載體培養(yǎng)Vero貼壁細(xì)胞增殖PRV，發(fā)現(xiàn)按照0.2×106cells·mL-1接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞密度可達(dá)5.8 × 106cells·mL-1，接毒后5 d，病毒滴度最高可達(dá) 11.13 lgTCID50。固定床片狀載體細(xì)胞培養(yǎng)較懸浮培養(yǎng)換液容易、可實(shí)現(xiàn)多次收毒，但該培養(yǎng)模式較難實(shí)現(xiàn)線性放大，工藝過程需要胰蛋白酶、血清等動(dòng)物來源輔料，片狀載體原料基本依賴進(jìn)口、價(jià)格昂貴。

本研究針對我國PR疫苗生產(chǎn)現(xiàn)狀和技術(shù)瓶頸，開展BHK-21細(xì)胞增殖PRV工藝研究[6,19]。從本單位細(xì)胞庫中，篩選出PRV敏感細(xì)胞株BHK-21-02貼壁和BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞，比較了低血清和無血清培養(yǎng)基中BHK-21-XF02細(xì)胞生長特性和增殖病毒特性，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種密度高低會(huì)直接影響細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)特性，接種密度過高導(dǎo)致細(xì)胞快速達(dá)到最大增殖密度，大量細(xì)胞代謝副產(chǎn)物急劇增加，迅速進(jìn)入衰亡期。接種密度過低會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間增加，大大增加了生產(chǎn)成本和污染風(fēng)險(xiǎn)。選擇合適倍增時(shí)間不僅有利于細(xì)胞最佳的生長狀態(tài)也有利于生產(chǎn)實(shí)際結(jié)合，降低生產(chǎn)成本[21]。從細(xì)胞生長狀態(tài)、病毒擴(kuò)增、疫苗生產(chǎn)三個(gè)方面綜合考慮，雖然在含3% NBS的低血清培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較SFM無血清懸浮培養(yǎng)基中優(yōu)勢明顯，但血清的添加將帶來生物安全的威脅、大大增加了生產(chǎn)成本，除此之外，血清的使用會(huì)對下游純化造成困難[11]。在無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞最大增殖密度也可達(dá)到(8.95±0.47)×106cells·mL-1，滿足生產(chǎn)需求。因此，優(yōu)選SFM無血清培養(yǎng)基進(jìn)行BHK-21-XF02細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)條件的優(yōu)化。從搖瓶到生物反應(yīng)器的比例通常是不一致的，不同的培養(yǎng)體積、溶解氧濃度以及攪拌轉(zhuǎn)速直接影響細(xì)胞的代謝水平和生長速率；因此，優(yōu)化影響細(xì)胞生長生理參數(shù)，包括操作變量(溫度、pH、接種密度、攪拌轉(zhuǎn)速和溶解氧濃度)、培養(yǎng)基組分和補(bǔ)充劑(如葡萄糖和氨基酸)是十分重要的。在此基礎(chǔ)上，本文篩選出了對PRV敏感的BHK-21-XF02細(xì)胞株，優(yōu)化了BHK-21-XF02細(xì)胞株在SFM-BHK無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件和PRV增殖條件，并實(shí)現(xiàn)了5 L生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，為相關(guān)研究和規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[22-24]。

4 結(jié) 論

篩選獲得PRV高敏感的BHK-21-02貼壁細(xì)胞和BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞各1株，BHK-21-XF02懸浮細(xì)胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培養(yǎng)基和SFM-BHK無血清培養(yǎng)基中均能實(shí)現(xiàn)良好的生長和病毒增殖。1.2 L反應(yīng)器最佳培養(yǎng)條件為接種密度1.20×106cells·mL-1、攪拌轉(zhuǎn)速120 r·min-1、DO值40%；5 L反應(yīng)器批培養(yǎng)72 h細(xì)胞密度可達(dá)(7.61±0.18)×106cells·mL-1、細(xì)胞活率為(96.93±1.18)%。1.2 L反應(yīng)器最佳病毒增殖條件為MOI 0.001、培養(yǎng)溫度37 ℃、細(xì)胞密度2.0×106cells·mL-1、攪拌轉(zhuǎn)速80 r·min-1；5 L反應(yīng)器批培養(yǎng)接毒后48 h病毒滴度達(dá)到最大值(7.13±0.11)lgTCID50·mL-1。