門凱凱，劉佳隆，郭亞格，何 雷，賈艷艷，余祖華

(河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室 洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

新城疫(Newcastle disease, ND)作為一種臨床上常見的家禽傳染性疾病，是一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病理特征的高度傳染性病毒病，主要侵襲家雞，也可感染其它家禽和野生禽類，是當(dāng)今全球范圍內(nèi)最重要的家禽傳染病之一，禽一旦感染新城疫病毒，極易被大腸桿菌、沙門菌等其它病原菌感染，進(jìn)而降低蛋雞產(chǎn)蛋量，增加育成雞死亡率[1-3]。目前在臨床禽病中，致病性大腸桿菌和沙門菌帶來的疾病仍然很多，給養(yǎng)殖戶造成很多的困擾，造成了經(jīng)濟損失，尤其當(dāng)其它病原(如新城疫病毒)感染后容易并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌性疾病，會造成更大的經(jīng)濟損失[4-5]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一種分泌性、炎癥性的多功能細(xì)胞因子，在抗微生物感染及機體免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[6-7]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的一個重要成員，TGF-β1蛋白包括1個精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid, RGD)基序和4個高度保守的同源性內(nèi)部重復(fù)結(jié)構(gòu)域，RGD基序作為一個配體可以與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和遷移[8-10]，TGF-β1編碼的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)菌黏附素等結(jié)合介導(dǎo)細(xì)菌黏附細(xì)胞[11]。細(xì)菌黏附是一種普遍存在的生物現(xiàn)象，是細(xì)菌致病的先決條件，也是細(xì)菌寄生活動的基礎(chǔ)和感染致病的前提[12-13]。那么家禽感染NDV后并發(fā)或繼發(fā)大腸桿菌、雞白痢沙門菌等細(xì)菌病與雞TGF-β1表達(dá)有怎樣的關(guān)聯(lián)，雞TGF-β1在致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌感染家禽中具有怎樣的作用需要進(jìn)一步研究。因此，本研究在檢測NDV感染DF1細(xì)胞后雞TGF-β1的表達(dá)量的基礎(chǔ)上，構(gòu)建雞TGF-β1的重組過表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞以調(diào)節(jié)雞TGF-β1的表達(dá)量，然后檢測雞TGF-β1對致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌黏附DF1細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步研究雞TGF-β1在臨床病毒感染繼發(fā)細(xì)菌性疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌(毒)株與質(zhì)粒 DF1細(xì)胞，大腸桿菌DH5α、致病性大腸桿菌(CVCC1527)和雞白痢沙門菌(C79-13)、雞新城疫病毒(La Sota株)，pUC57、pG1.2、pDC316-mCMV-ZsGreen載體質(zhì)粒均由河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生實驗室保存。

1.1.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BsaI(RO535V)、SacI(ER1135)分別購于NEB和Thermo Scientific，NheI(D6489)和Hind III(1615)分別購于Beyotime和TaKaRa，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、SYBRGreenMasterMix(RR420)購于TaKaRa公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基均購于美國Invitrogen公司；TRIzol試劑購于GenStar公司；雞TGF-β1 ELISA試劑盒購于瑞信生物公司。

1.2 方法

1.2.1 DF1細(xì)胞的培養(yǎng)與NDV感染 DF1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的DF1細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞數(shù)接種于24孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后進(jìn)行NDV感染試驗。NDV感染試驗分為2組，即NDV感染組和空白組。用PBS清洗細(xì)胞2遍，按5 MOI·孔-1將NDV感染DF1細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h后更換為含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞樣品，4 000 r·min-1離心10 min，再收集上清備用。

1.2.2 雞TGF-β1基因重組過表達(dá)載體的構(gòu)建 本研究通過GenBank雞TGF-β1(NM-001318456.1)序列和載體pDC316-mCMV-ZsGreen多克隆位點，設(shè)計、合成兩端分別含有限制性酶切位點NheI和Hind III的雞TGF-β1片段，并將合成片段克隆入pUC57載體構(gòu)建克隆載體pUC57-chickenTGF-β1，然后用NheI和Hind III雙酶切pUC57-chickenTGF-β1，回收大小約1 200 bp的雞TGF-β1條帶，將其與經(jīng)NheI+Hind III酶切pDC316-mCMV-ZsGreen質(zhì)粒后回收的大片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含氨芐(Amp+)抗性的LB固體平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱12～16 h。挑取陽性單菌落接種于含Amp+抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將酶切正確的質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 雞TGF-β1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞 按照“1.2.1”步驟培養(yǎng)和處理細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗。共分成3組，即空白組、雞TGF-β1重組過表達(dá)質(zhì)粒(pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1)組和重組干擾表達(dá)(pG1.2-chickenTGF-β1)組，每組3個重復(fù)。具體方法如下：于轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清的DMEM培養(yǎng)基。用100 μL的opti-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，室溫靜置5 min，以質(zhì)粒∶Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑=1 μg∶2 μL的比例配制opti-MEM培養(yǎng)基-脂質(zhì)體復(fù)合物100 μL，混勻后室溫靜置5 min。將兩液混合均勻靜置20 min后加入DF1細(xì)胞內(nèi)輕輕混勻。6 h后換入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心10 min，分別收集上清和細(xì)胞沉淀備用。

1.2.5 雞TGF-β1 mRNA表達(dá)量檢測 以TRIzol法提取轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR Green Master Mix進(jìn)行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各組TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 雞TGF-β1胞外蛋白的表達(dá)量檢測 采用雞TGF-β1 ELISA試劑盒檢測NDV感染和雞TGF-β1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中雞TGF-β1胞外蛋白的表達(dá)量。按照試劑盒說明書進(jìn)行試驗操作，然后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度(OD值)為橫坐標(biāo)，利用計算機Excel表格軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合(4-pl)，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度(OD值)，利用方程計算樣品的濃度值。

1.2.7 細(xì)菌對DF1細(xì)胞的黏附檢測 按照“1.2.1”步驟培養(yǎng)和處理細(xì)胞，按照“1.2.4”步驟進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察，并用內(nèi)參GAPDH對DF1細(xì)胞進(jìn)行定量，確定各組細(xì)胞在數(shù)量上無顯著差異，然后進(jìn)行細(xì)菌黏附試驗。取處于對數(shù)生長期致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，收集細(xì)菌，加入一定量無菌PBS重懸，按照MOI=100∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)的比值將菌液加入到細(xì)胞中，1 000 r·min-1離心5 min后置于CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。孵育2 h后收集上清，并用無菌PBS清洗孔板中的細(xì)胞3次，收集清洗液，將上清和清洗液混合離心，用1 mL的無菌PBS重懸收集未黏附的細(xì)菌至無菌EP管中。加入1 mL的無菌PBS，用細(xì)胞刮將細(xì)胞重懸，收集黏附的細(xì)菌至無菌EP管中。將未黏附的細(xì)菌和黏附的細(xì)菌重懸液分別振蕩混勻，連續(xù)10倍倍比稀釋后，涂布于LB固體瓊脂平板上，采用平板菌落計數(shù)法對細(xì)菌計數(shù)；將回收的兩菌16S rDNA擴增基因產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)兩菌的16S rDNA序列設(shè)計特異性引物，將兩菌標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后取相當(dāng)于1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU·mL-1細(xì)菌的DNA樣品作為標(biāo)準(zhǔn)模板，用熒光實時定量PCR法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對黏附和未黏附的大腸桿菌和雞白痢沙門菌進(jìn)行定量。試驗重復(fù)3次，計算細(xì)菌對細(xì)胞的黏附率。

2 結(jié) 果

2.1 NDV感染對DF1細(xì)胞雞TGF-β1表達(dá)的影響

NDV感染DF1細(xì)胞后48 h用雞TGF-β1 ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白組相比，NDV感染組DF1細(xì)胞雞TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05，圖1)。

*. 表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 雞TGF-β1重組過表達(dá)載體的鑒定

構(gòu)建的重組過表達(dá)質(zhì)粒pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1經(jīng)NheI+Hind III雙酶切后出現(xiàn)大小分別為5 800和1 200 bp兩條帶(圖2)。陽性質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，插入片段長度為1 197 bp，序列比對結(jié)果與雞TGF-β1序列完全匹配。結(jié)果表明，目的片段以正確方向插入表達(dá)載體pDC316-mCMV-ZsGreen中，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1。

M. Trans2K plus marker; 1. pDC316-mCMV-ZsGreen-chicken TGF-β1雙酶切產(chǎn)物

2.3 雞TGF-β1重組干擾表達(dá)載體的鑒定

根據(jù)pG1.2載體序列，在設(shè)計雞TGF-β1干擾表達(dá)片段時引入一個SacⅠ的酶切位點，因pG1.2載體本身有一個SacⅠ的酶切位點，因此，提取的陽性重組質(zhì)粒能被SacⅠ酶切出一條約600 bp條帶時，表明退火片段成功連接到pG1.2載體里。電泳結(jié)果顯示，挑取的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ酶切后，可獲得一條大小約600 bp的片段(圖3)，且序列比對結(jié)果與插入序列完全匹配。結(jié)果表明，目的片段以正確方向插入載體PG1.2，成功構(gòu)建了干擾表達(dá)載體pG1.2-chickenTGF-β1。

M.DL15000 marker; 1、2、3. pG1.2-chicken TGF-β1雙酶切產(chǎn)物

2.4 轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒對DF1細(xì)胞的雞TGF-β1表達(dá)的影響

將重組過表達(dá)載體pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1和干擾表達(dá)載體pG1.2-TGF-β1 shRNA轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后48 h，在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到熒光信號(圖4)，分別用熒光定量PCR和雞TGF-β1 ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量和胞外蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白組相比，pG1.2-TGF-β1 shRNA組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，而pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；pG1.2-TGF-β1 shRNA組細(xì)胞TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，而pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1組細(xì)胞TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01，圖5)。

A. pDC316-mCMV-ZsGreen-chicken TGF-β1轉(zhuǎn)染的DF1細(xì)胞；B. pG1.2-TGF-β1 shRNA轉(zhuǎn)染的DF1細(xì)胞；C. 未轉(zhuǎn)染的DF1細(xì)胞對照

A. DF1細(xì)胞TGF-β1 mRNA的相對表達(dá)量；B. DF1細(xì)胞TGF-β1胞外蛋白的表達(dá)量。**. 表示差異顯著(P<0.01)，下同

2.5 雞TGF-β1的表達(dá)對致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌黏附DF1細(xì)胞的影響

用雞TGF-β1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后48 h對各組細(xì)胞進(jìn)行定量，與空白對照組細(xì)胞相比，pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1轉(zhuǎn)染組和pG1.2-TGF-β1 shRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量上無差異(P>0.05，圖6)。涂板計數(shù)法和定量分析法計算致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌對DF1細(xì)胞的黏附率，檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌對pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1轉(zhuǎn)染組DF1細(xì)胞的黏附率顯著增高(P<0.01)，對pG1.2-TGF-β1 shRNA-1轉(zhuǎn)染組DF1細(xì)胞的黏附率顯著降低(P<0.01,圖7)。

圖6 雞TGF-β1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后48 h細(xì)胞數(shù)量分析

A.致病性大腸桿菌對DF1細(xì)胞的黏附；B.未黏附的致病性大腸桿菌；C.雞白痢沙門菌對DF1細(xì)胞的黏附；D.未黏附的雞白痢沙門菌

3 討 論

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，家禽的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)也在不斷進(jìn)步，且已經(jīng)獲得了較為明顯的經(jīng)濟效益。在養(yǎng)殖過程中，家禽疾病是影響家禽飼養(yǎng)場經(jīng)濟效益的主要原因，同時給基層獸醫(yī)的工作帶來了一定的挑戰(zhàn)[14-15]。有研究表明，威脅家禽養(yǎng)殖行業(yè)的疾病有80余種，其中傳染性疾病占比最大，約為75%，傳染性疾病對養(yǎng)禽業(yè)之所以危害大，是因為其通常并發(fā)或繼發(fā)于其它疾病，導(dǎo)致病情復(fù)雜，且治療困難[16-17]。臨床混合感染是當(dāng)前禽病流行的主要趨勢，一些雞場經(jīng)常發(fā)生以新城疫為主，混合感染大腸桿菌病和雞白痢沙門菌等細(xì)菌性疾病，而且混合感染的病例越來越多，出現(xiàn)病毒+細(xì)菌或細(xì)菌+細(xì)菌的傳染病，成為養(yǎng)禽業(yè)一大隱患[18-21]。近年來，隨著疫苗的使用和環(huán)境的改變，混合感染的比例逐漸升高，對養(yǎng)殖業(yè)造成的損失逐漸攀升。因此，探究混合感染發(fā)生發(fā)展的機制能為臨床混合感染提供有效的幫助。新城疫病毒感染機體，侵害機體免疫系統(tǒng)，使禽對細(xì)菌性疾病的易感性提高；或相互作用，讓各自的致病力增強，給臨床防控和治療造成很大的阻力，這可能是引發(fā)目前我國部分地區(qū)雞群多種疾病暴發(fā)，使養(yǎng)禽業(yè)的疫病更加復(fù)雜和嚴(yán)重的主要原因之一。探索新城疫和細(xì)菌性疾病混合感染的機制，對臨床混合感染的防治具有重要意義。在本研究中，通過檢測NDV感染DF1細(xì)胞后雞TGF-β1胞外蛋白量，發(fā)現(xiàn)與未感染組相比，NDV感染組DF1細(xì)胞的TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量顯著增加，表明NDV感染可導(dǎo)致雞TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量顯著增高，這為進(jìn)一步探索雞TGF-β1表達(dá)量的變化對細(xì)菌疾病發(fā)生的影響奠定了基礎(chǔ)。

RNA干擾技術(shù)可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)序列特異的靶基因表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象[22-23]，為研究雞TGF-β1的功能以及在臨床禽病中的調(diào)控機制，本研究結(jié)合RNA干擾技術(shù)和基因重組技術(shù)，以雞TGF-β1為靶目標(biāo)，分別成功構(gòu)建了pG1.2-TGF-β1 shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒和pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1過表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步實現(xiàn)調(diào)控DF1細(xì)胞中雞TGF-β1表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，48 h后檢測細(xì)胞TGF-β1 mRNA和TGF-β1胞外蛋白的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞對照組相比，pG1.2-TGF-β1 shRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均顯著下調(diào)DF1細(xì)胞的TGF-β1 mRNA的表達(dá)量和TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量；pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均顯著上調(diào)DF1細(xì)胞的TGF-β1 mRNA的表達(dá)量和TGF-β1胞外蛋白表達(dá)量。這為進(jìn)一步研究雞TGF-β1對致病菌黏附細(xì)胞的影響提供了模型，也為后續(xù)進(jìn)一步探索TGF-β1及其調(diào)控的關(guān)鍵分子在臨床禽病中的作用奠定基礎(chǔ)。

在通過將雞TGF-β1重組過表達(dá)和干擾表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)量的基礎(chǔ)上，檢測雞TGF-β1的表達(dá)對致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌黏附DF1細(xì)胞的影響，本試驗采用涂板計數(shù)法和定量分析法驗證細(xì)菌對細(xì)胞的黏附，結(jié)果顯示，與空白對照組DF1細(xì)胞相比，大腸桿菌和雞白痢沙門菌對過表達(dá)質(zhì)粒pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1組DF1細(xì)胞的黏附率顯著增高，對干擾表達(dá)質(zhì)粒pG1.2-TGF-β1 shRNA組DF1細(xì)胞的黏附率顯著減少，表明本研究構(gòu)建的干擾表達(dá)質(zhì)粒pG1.2-TGF-β1 shRNA和過表達(dá)質(zhì)粒pDC316-mCMV-ZsGreen-chickenTGF-β1轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，對DF1細(xì)胞TGF-β1胞外蛋白的表達(dá)量有顯著的調(diào)控作用，從而有效影響大腸桿菌和雞白痢沙門菌對DF1細(xì)胞的黏附作用，這與馬麗莉[24]研究結(jié)果一致。這說明雞TGF-β1可增加致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌對DF1細(xì)胞的黏附，NDV感染后雞TGF-β1表達(dá)的變化可能是病毒感染后并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌性疾病的原因之一，這為TGF-β1在臨床禽病防控中的應(yīng)用提供了參考。雞TGF-β1在多種禽病的發(fā)生發(fā)展中都扮演著重要角色，這也預(yù)示著雞TGF-β1可能在多種禽病的混合感染中發(fā)揮著重要作用。雞TGF-β1在禽病混合感染中的作用機制也將成為下一步研究的重點，本研究也為繼續(xù)探究雞TGF-β1在禽病混合感染中的作用機制提供支持。

4 結(jié) 論

本研究以臨床常見的新城疫病毒、致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌作為研究對象，初步證明NDV感染DF1細(xì)胞后，雞TGF-β1的表達(dá)量增加，雞TGF-β1可促進(jìn)致病性大腸桿菌和雞白痢沙門菌黏附DF1細(xì)胞，初步確定了雞TGF-β1在新城疫、大腸桿菌和雞白痢沙門菌混合感染中的作用，為研究雞TGF-β1在病毒+細(xì)菌感染中的作用及機制提供重要的參考。