蔣 凱，趙鵬宇，王天碩，于思雯，畢 欄，肖佳薇，賀顯晶，郭東華

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319)

壞死桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)是一種無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢、嚴(yán)格厭氧的多形性革蘭陰性菌，其常駐于人類或動(dòng)物的口腔、消化道和泌尿生殖道[1-2]。壞死桿菌作為機(jī)會(huì)主義病原可以引起反芻動(dòng)物的腐蹄病、犢牛白喉、肉牛肝膿腫、奶牛乳腺炎和馬的呼吸道感染等壞死性化膿性疾病，也會(huì)引起人化膿性血栓頸靜脈炎為主的Lemierre’s綜合征，同時(shí)可誘發(fā)結(jié)腸癌[3-5]。因此，壞死桿菌感染給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失并威脅人類的健康與安全，對(duì)其致病機(jī)制的研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

壞死桿菌的毒力因子主要包括白細(xì)胞毒素、內(nèi)毒素、黏附因子和一些胞外酶等。其中白細(xì)胞毒素被認(rèn)為是壞死桿菌的主要毒力因子，它對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞有毒害作用，并且對(duì)人和反芻動(dòng)物的中性粒細(xì)胞具有特異性損傷[6-7]。但針對(duì)壞死桿菌白細(xì)胞毒素制備的亞單位疫苗保護(hù)效果不佳，有必要對(duì)壞死桿菌其他毒力因子或功能蛋白進(jìn)行拓展性研究。黏附因子也是壞死桿菌的主要毒力因子之一，外膜蛋白(out membrane proteins, OMPs)在革蘭陰性菌黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也參與營(yíng)養(yǎng)介導(dǎo)、耐藥性和生物被膜形成等生物過(guò)程[8]。2013年，Sun等[9]首次在牛壞死桿菌H05菌株上鑒定43K OMP，并發(fā)現(xiàn)其與同菌屬的具核梭桿菌外膜蛋白FomA同源性達(dá)70.22%，且與其他梭菌屬的OMPs具有高度保守性。對(duì)比壞死桿菌的Fnn亞種和Fnf亞種的主要OMPs，發(fā)現(xiàn)Fnn亞種OMPs顯著性條帶為40 ku，F(xiàn)nf亞種OMPs則為37.5 ku，這也解釋了Fnn亞種和Fnf亞種壞死桿菌毒性的差異[10-11]。同時(shí)，43K OMP在牛羊腐蹄病臨床分離株中廣泛存在[12]。利用抗體抑制試驗(yàn)和蛋白競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，43K OMP在壞死桿菌黏附宿主細(xì)胞中可能發(fā)揮潛在作用，利用43K OMP截短表達(dá)制備的多抗，初步篩選了43K OMP的黏附功能區(qū)[13]。而有關(guān)于43K OMP在壞死桿菌致病中的其他生物學(xué)功能尚未可知，因此，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)構(gòu)建牛壞死桿菌43K OMP缺失株，對(duì)比其與壞死桿菌親本株的生物學(xué)特性，初步探究缺陷43K OMP后壞死桿菌的生物學(xué)特性的變化，從而確定43K OMP基因可能參與壞死桿菌致病的生物學(xué)功能，為牛壞死桿菌致病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞與試驗(yàn)動(dòng)物

壞死桿菌A25菌株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司(Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)nn亞種，ATCC 25286)，基因缺失株A25Δ43K OMP株通過(guò)同源重組技術(shù)制備獲得(構(gòu)建同源重組手臂并通過(guò)自殺質(zhì)粒導(dǎo)入壞死桿菌內(nèi)部，從而打斷43K OMP基因)[14]，小鼠單核巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)與牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞系(BEND)由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)獸醫(yī)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑、儀器

苛養(yǎng)厭氧菌肉湯(FAB)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，藥敏紙片購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司，BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，厭氧培養(yǎng)箱購(gòu)自上海龍躍儀器設(shè)備有限公司，熒光顯微鏡購(gòu)自上海徠卡科技有限公司。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將牛壞死桿菌親本株A25株與基因缺失株A25Δ43K OMP株甘油凍存菌復(fù)蘇接種于FAB培養(yǎng)基中(其中基因缺失株A25Δ43K OMP株培養(yǎng)基含有2 μg·mL-1甲砜霉素)，37 ℃厭氧培養(yǎng)，氣體環(huán)境為：85% N2、10% H2和5% CO2，經(jīng)革蘭染色鑒定后，按照1∶50傳代，傳3～4代可用于試驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中、BEND細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞均在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將兩菌株按照1∶20比例分別接種到FAB液體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48 h取菌液2 mL測(cè)定其600 nm的吸光度值，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組，記錄并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，使用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)兩菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)[15]。取50 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，貼藥敏紙片，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察抑菌圈大小，測(cè)量抑菌圈直徑并記錄分析。

1.7 生物被膜形成能力測(cè)定

將親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株接種至FAB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后，將菌液用FAB培養(yǎng)基進(jìn)行100倍稀釋，取200 μL菌液加入至96孔板內(nèi)，37 ℃厭氧分別培養(yǎng)48、72和96 h，蒸餾水沖洗，隨后用1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，蒸餾水沖洗后加入200 μL 95%乙醇溶液溶解30 min，檢測(cè)OD570 nm值[16]，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組。

1.8 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

將親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株接種至FAB培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至OD600 nm=0.6～0.8，收集細(xì)菌于室溫3 000×g離心5 min，無(wú)菌PBS洗3次，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。同時(shí)將BEND細(xì)胞接種在12孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h用于試驗(yàn)，按照感染復(fù)數(shù)MOI為1∶100的比例加入細(xì)菌，共同孵育1 h。隨后用無(wú)菌PBS清洗3次除去未黏附的細(xì)菌，用1 mL無(wú)菌PBS收集細(xì)胞懸液并用連續(xù)10倍稀釋，涂布于固體培養(yǎng)基上37 ℃厭氧培養(yǎng)36～48 h，計(jì)算細(xì)菌的黏附數(shù)[17]，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組。

1.9 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

收集親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株并分別用DMEM培養(yǎng)基重懸。同時(shí)將RAW264.7細(xì)胞接種在12孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h用于試驗(yàn)，按照感染復(fù)數(shù)MOI為1∶100的比例加入細(xì)菌，分別孵育2、4和6 h后，按照BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，用熒光顯微鏡以400倍視野觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[18]。

1.10 缺失株對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)

將6周齡Balb/c雌性小鼠平均分為3組，分別為：親本株A25、缺失株A25Δ43K OMP和對(duì)照組，每組10只。將菌液用無(wú)菌PBS洗3遍后重懸，200 μL腹腔接種至小鼠體內(nèi)(5×108CFU·只-1)來(lái)測(cè)定存活曲線，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS。從接種后開始計(jì)時(shí)，連續(xù)觀察14 d，并繪制小鼠的存活曲線。對(duì)死亡小鼠及存活14 d小鼠進(jìn)行無(wú)菌剖檢，將肝組織研磨后，用無(wú)菌PBS對(duì)組織勻漿進(jìn)行倍比稀釋，涂布于固體平板37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，平板計(jì)數(shù)并計(jì)算兩菌株在Balb/c雌性小鼠每克肝組織中的載菌量。

1.11 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件One-way ANOVA進(jìn)行分析，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05時(shí)判定結(jié)果差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)曲線

為了探究缺陷43K OMP基因是否會(huì)影響牛壞死桿菌的生長(zhǎng)特性，分別檢測(cè)了兩菌株的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖1所示，親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株均在4～8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)菌密度逐漸減弱。結(jié)果顯示，缺陷43K OMP基因后牛壞死桿菌的生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

圖1 A25株和A25Δ43K OMP株生長(zhǎng)曲線

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

為了探究缺陷43K OMP基因是否會(huì)對(duì)牛壞死桿菌的耐藥性產(chǎn)生影響，選用25種抗菌藥物對(duì)親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，兩菌株對(duì)鏈霉素、桿菌肽和氟苯尼考高度耐藥，未出現(xiàn)抑菌圈。在缺陷牛壞死桿菌43K OMP基因后，缺失株A25Δ43K OMP株對(duì)氨芐西林、紅霉素、大觀霉素、磺胺甲噁唑和痢特靈產(chǎn)生的抑菌圈變小，表現(xiàn)出耐藥性增強(qiáng)；對(duì)克拉霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、奈替米星、呋喃妥因、多黏菌素B、利福平和環(huán)丙沙星產(chǎn)生的抑菌圈變大，表現(xiàn)出耐藥性減弱。

表1 A25和A25Δ43K OMP藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 生物被膜檢測(cè)結(jié)果

為了探究缺陷43K OMP基因是否對(duì)牛壞死桿菌的生物被膜形成能力產(chǎn)生影響，用結(jié)晶紫染色法分別對(duì)兩菌株進(jìn)行生物被膜測(cè)定。結(jié)果如圖2所示，接種48、72和96 h時(shí)，對(duì)照組OD570 nm分別為0.10、0.08和0.09，親本株A25 OD570 nm分別為0.40、0.49和0.50，缺失株A25Δ43K OMP OD570 nm分別為0.57、3.30和1.57。均表現(xiàn)為ODA25Δ43K OMP>ODA25>2×OD570 nm。結(jié)果顯示，兩菌株生物被膜形成能力均較強(qiáng)，且缺陷43K OMP基因后，牛壞死桿菌的生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)。

ns. P>0.05； ***. P<0.000 5。下同

2.4 細(xì)胞黏附能力測(cè)定結(jié)果

為了探究缺陷43K OMP基因是否對(duì)牛壞死桿菌的黏附能力產(chǎn)生影響，測(cè)定了兩菌株對(duì)BEND細(xì)胞的黏附能力。結(jié)果如圖3所示，親本株與缺失株在BEND細(xì)胞上黏附的細(xì)菌量分別為6.48×105和0.33×105CFU·mL-1。結(jié)果顯示，缺陷43K OMP基因后，可顯著降低牛壞死桿菌與BEND細(xì)胞的黏附。

圖3 A25株和A25Δ43K OMP株對(duì)BEND細(xì)胞黏附能力

2.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

為了探究缺陷43K OMP基因是否對(duì)牛壞死桿菌的毒性產(chǎn)生影響，在體外分別測(cè)定兩菌株對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖抑制能力。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組、親本株組和缺失株組的細(xì)胞增殖率在2 h分別為0.40、0.31和0.37，在4 h時(shí)分別為0.38、0.22和0.18，在6 h時(shí)分別為0.39、0.07和0.06(圖4B)。結(jié)果顯示，缺陷43K OMP基因，牛壞死桿菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

A. 從各組中隨機(jī)選擇視野并合并9張圖像(400×)；B. 從熒光圖像中獲得EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU相對(duì)陽(yáng)性率

2.6 對(duì)Balb/c雌性小鼠致病力的影響

為了探究缺陷43K OMP基因后，牛壞死桿菌對(duì)Balb/c雌性小鼠的致病力是否會(huì)發(fā)生改變，將兩菌株用無(wú)菌PBS稀釋后腹腔注射試驗(yàn)組小鼠，每只接種5×108CFU細(xì)菌，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量無(wú)菌PBS溶液，觀察小鼠死亡時(shí)間情況及全身病理變化情況。結(jié)果如圖5所示，親本株A25株和缺失株A25Δ43K OMP株對(duì)Balb/c雌性小鼠的致死率分別為100%和80%。感染親本株A25株的小鼠死亡時(shí)間主要集中在前3 d，感染缺失株A25Δ43K OMP株的小鼠主要集中在5～7 d(圖5A)。對(duì)小鼠無(wú)菌解剖發(fā)現(xiàn)，感染A25株小鼠臟器無(wú)明顯變化，感染A25Δ43K OMP株小鼠心、腎無(wú)明顯變化，肺充血，脾充血腫大，肝表面出現(xiàn)散在的米粒大小的黃白色壞死灶，部分出現(xiàn)黃白色大片干酪樣壞死并與腹膜黏連。對(duì)Balb/c雌性小鼠肝組織進(jìn)行細(xì)菌載量計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，親本株A25株與缺失株A25Δ43K OMP株的肝細(xì)菌載量分別為2.29×105和1.72×105CFU·g-1，缺失株A25Δ43K OMP株定植在肝的細(xì)菌數(shù)量顯著低于親本株A25株(P<0.05,圖5B)。結(jié)果表明，缺陷43K OMP基因后，牛壞死桿菌對(duì)Balb/c雌性小鼠的致病力降低。

A. 各菌株對(duì)小鼠的存活曲線；B. 各菌株在小鼠肝組織的細(xì)菌載量。*. P<0.05

3 討 論

近年來(lái)，壞死桿菌感染引起的牛肝膿腫、腐蹄病、乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎等壞死桿菌疾病，對(duì)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展；壞死桿菌病不僅影響經(jīng)濟(jì)動(dòng)物還威脅到人類的生命安全，多地均報(bào)道過(guò)人類感染壞死桿菌的病例[19-21]。壞死桿菌如何感染動(dòng)物機(jī)體并導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病的機(jī)制研究尚未明確。

OMPs作為革蘭陰性細(xì)菌的重要組成部分，在細(xì)菌致病中發(fā)揮重要作用。43K OMP作為壞死桿菌的重要OMPs，前期研究發(fā)現(xiàn)其與細(xì)菌黏附功能有關(guān)。當(dāng)壞死桿菌與43K OMP多抗孵育或43K OMP與細(xì)胞孵育后，壞死桿菌黏附宿主細(xì)胞能力降低[10]；同時(shí)將43K OMP基因克隆到pFLAG-CTS載體中，隨后在大腸桿菌BL21 DE3表達(dá)后，大腸桿菌的黏附能力增強(qiáng)[22]。這些結(jié)果顯示，43K OMP在壞死桿菌黏附宿主細(xì)胞中具有重要作用，但壞死桿菌黏附是否與43K OMP基因具有直接作用尚不可知。因此，本研究對(duì)比43K OMP基因缺失株和牛壞死桿菌親本株對(duì)BEND細(xì)胞的黏附能力，發(fā)現(xiàn)缺陷43K OMP的牛壞死桿菌對(duì)BEND細(xì)胞的黏附能力顯著降低，這與之前的研究結(jié)果相一致。表明43K OMP基因直接介導(dǎo)壞死桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附功能。

生物被膜是細(xì)菌抵抗外界不利環(huán)境的一種生存形式，主要由細(xì)菌、蛋白質(zhì)、胞外多糖和胞外DNA構(gòu)成，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和造成動(dòng)物疾病持續(xù)感染的重要機(jī)制。Ye等[23]研究發(fā)現(xiàn)，阪崎氏菌(Cronobactersakazakii)缺失OmpW后，阪崎氏菌的生物被膜含量顯著增強(qiáng)。Yonezawa等[24]研究發(fā)現(xiàn)，缺失幽門螺桿菌的外膜蛋白AlpB導(dǎo)致幽門螺桿菌形成生物被膜含量顯著下降。牛壞死桿菌缺陷43K OMP基因后，其生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)，顯示牛壞死桿菌43K OMP基因介導(dǎo)生物被膜的產(chǎn)生，而43K OMP基因引起的生物被膜形成能力的變化是與抵抗外界不利因素有關(guān)還是直接參與到生物被膜的形成還需進(jìn)一步研究。

細(xì)菌的耐藥機(jī)制有很多種，如外排泵排出、細(xì)胞膜通透性改變、藥物靶點(diǎn)基因突變等，外排泵多由孔狀外膜蛋白構(gòu)成，而外排泵系統(tǒng)也是介導(dǎo)細(xì)菌固有耐藥和獲得耐藥的重要機(jī)制[25]。Jeanteur等[26]將大腸桿菌的OmpF突變后，大腸桿菌對(duì)頭孢菌素的耐藥性降低；權(quán)衡等[27]敲除鴨疫里默氏桿菌的rant基因后，該菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性降低。牛壞死桿菌43K OMP是由β-折疊平行排列構(gòu)成的桶裝蛋白，其中包含9個(gè)跨膜區(qū)域，與梭菌屬的多種外膜成孔蛋白具有較高的相似性[9]。本研究中，壞死桿菌缺陷43K OMP基因?qū)е缕鋵?duì)部分抗菌藥物耐藥性發(fā)生變化，說(shuō)明43K OMP基因參與到細(xì)菌的耐藥功能中，但其究竟是以外排泵的形式還是以改變細(xì)胞膜通透性或介導(dǎo)改變藥物靶基因突變從而導(dǎo)致耐藥性發(fā)生變化還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

牛壞死桿菌43K OMP基因被缺陷后，牛壞死桿菌的黏附能力顯著下降，生物被膜形成能力顯著提升，耐藥性產(chǎn)生變化，對(duì)小鼠致病力顯著下降。