劉丹丹 張孝飛 王錦 黃慧華 程雪松

小細胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是神經(jīng)內(nèi)分泌細胞來源的肺惡性腫瘤，占每年全球肺癌新發(fā)病例的15%～20%[1-2]。SCLC惡性程度在所有類型肺癌中最高。目前晚期小細胞肺癌的主要治療方法包含放療和化療[3- 4]。免疫治療僅能使少數(shù)患者獲益[5]。DLL3基因別名SCDO1，有研究表明，DLL3基因突變可能導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常[6-7]，且在SCLC腫瘤組織及非腫瘤組織中具有差異表達的特征[8-10]，DLL3可促進SCLC的增殖、侵襲[11]，但目前關(guān)于DLL3在SCLC預(yù)后中的價值存在爭議[12]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron- specifc enolase,NSE)被認為是診斷惡性腫瘤的生物標志物[12]。研究證實，NSE在SCLC患者細胞中高表達通常提示預(yù)后不佳[13-14]。 但是，血清NSE水平可能由于其檢測方法和抗體不同而有所不同[15]。部分非腫瘤性疾病也可引起血清NSE水平升高，例如顱腦損傷[16]，因此其缺乏特異性。本研究旨在研究DLL3在組織中的表達聯(lián)合血清NSE水平對評估SCLC患者預(yù)后中的價值。

資料與方法

一、一般資料

篩選自2017年1月至2020年12月在安徽省第二人民醫(yī)院和亳州市人民醫(yī)院首次診斷為SCLC且未治療的97例患者，其中男性83例，女性14例，依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC) 2017肺癌TNM分期將上述患者分為Ⅲ期35例，Ⅳ期62例，具體臨床特征(見表1)。所有標本均來源于氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺標本。納入標準：(1)年齡 ≥ 18歲；(2)肺部具有可評估的病灶；(3)ECOG評分0～1分；(4)存活時間 ≥ 2個月；排除標準：(1)合并嚴重的心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病和肝腎功能不全；(2)合并其他系統(tǒng)原發(fā)腫瘤或者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性腫瘤；在手術(shù)或任何其他治療之前，采用ELISA法測量NSE的血清濃度， Meta分析結(jié)果[17]指出NSE臨界值范圍為7.5 ng/mL至35 ng/mL，因此本實驗選擇的臨界值為35ng/mL。該研究已通過兩家醫(yī)院倫理委員會批準，[(L)2021-001]。

二、實驗方法

采用免疫組化的方式檢測DLL3在SCLC組織中的表達情況。簡要步驟：石蠟包埋組織切片脫蠟水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)20min，3%H2O2孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS緩沖液沖洗，DLL3單克隆抗體(E3J5R，購自美國Abcam公司)按1:100稀釋后，置于4℃環(huán)境中過夜，生物素標記的二抗37℃孵育15min，37℃SABC孵育15min，DAB染色，蘇木素再次染色，酒精脫水，中性樹膠封片。用半定量分析計數(shù)系統(tǒng)，采用免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，根據(jù)染色強度(staining intensity, SI)和陽性細胞百分率(percentage of positive cells, PPC)綜合計分進行結(jié)果判定。其中染色強度分為以下幾種：無染色-0分、弱染色-1分、中等染色-2分、強染色-3分，陽性細胞的百分率：無陽性細胞-0分、<10%陽性細胞-1分、 10%～50%陽性細胞-2分、≥50%～80%陽性細胞-3分、≥80%陽性細胞-4分，將染色強度和陽性細胞百分率乘積總分(immuno-reactive sum score, IRS)進行分組，即IRS=SI×PPC，IRS≥6分：高表達組(DLL3- high)，<6分：低表達組(DLL3-low)。根據(jù)陽性細胞的百分率進行分組，≥50%的腫瘤細胞表達為高表達組，<50%為低表達組[18]。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0版進行數(shù)據(jù)分析，臨床病理特征的組間比較采用χ2檢驗，應(yīng)用Kaplan-Meier方法進行單因素生存分析，對數(shù)秩和檢驗 Log-Rank法進行生存曲線比較; 對影響生存期的因素采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行分析。P值小于0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床特征

本項研究共納入97例首次診斷為SCLC且未治療的患者，男性83例，女性14例，男性占比85%，女性占比15%。DLL3表達與常見臨床變量的關(guān)系見下表(見表1)，其中可見血清NSE與DLL3呈正相關(guān)，低DLL3表達和血清NSE<35ng/mL的患者呈現(xiàn)出最佳的生存期。

二、DLL3在SCLC腫瘤組織中的表達情況

DLL3在84.5%(82/97)SCLC石蠟包埋組織中表達，陽性表達為細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒(見圖1)，其中34例(35.1%)患者為高表達，48例(49.5%)患者為低表達，15例為陰性表達。根據(jù)上述分組標準，最終34例患者為高表達組，63例患者為低表達組。DLL3表達與血清NSE呈正相關(guān)，而與患者性別、年齡、分期、腫瘤大小、化療周期無相關(guān)性(P>0.05)(見表1)。

圖1 DLL3在SCLC腫瘤組織中的表達情況(免疫組化 ×200)

表1 DLL3表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

三、DLL3蛋白表達、血清NSE與SCLC預(yù)后的關(guān)系

分析預(yù)后的指標為無進展生存期(progression-free survival，PFS)，定義為從首次診斷至疾病進展或患者死亡時間?？偵嫫?overall survival，OS)，定義為從首次診斷到死亡或最后一次隨訪的時間。DLL3高表達組與低表達組的中位PFS分別為4.2 (區(qū)間: 3.1～5.3)和6.6 (區(qū)間:5.6～7.6)個月，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。中位OS分別為12和12.3個月，兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.940(見圖2)。

圖2 DLL3蛋白在腫瘤組織中的表達對SCLC患者生存時間的影響

NSE<35ng/mL組的PFS和OS均長于NSE≥35 ng/mL組6.6，5.0個月和15.4，13.3個月，P<0.05(見圖3)。為進一步探究DLL3在組織中的表達水平聯(lián)合血清NSE在評估SCLC預(yù)后中的價值，將患者分為4組(組1=DLL3-low + NSE<35ng/mL(n=37)，組2=DLL3-low +NSE≥35ng/mL(n=26)，組3=DLL3-high + NSE<35ng/mL(n=9)，組4=DLL3-high +NSE≥35ng/mL(n=25)。由于第三組樣本量較少且失訪嚴重，因此未將組3進行生存比較。在其余三組結(jié)果發(fā)現(xiàn)低DLL3表達和血清NSE<35ng / L的患者具有最佳生存期(P<0.01)(見圖4)。

圖3 治療前血清NSE水平對SCLC患者生存時間的影響

圖4 DLL3蛋白表達聯(lián)合治療前血清NSE水平對晚期SCLC患者生存時間的影響

四、其他因素對SCLC預(yù)后的影響

采用Cox多因素回歸模型探究其他因素對SCLC預(yù)后的影響，結(jié)果顯示DLL3的高表達(HR=2.122; 95%CI 1.164～3.868;P=0.014)，女性(HR=0.355; 95%CI 0.127～0.991;P=0.048)和最大腫瘤尺寸>5cm(HR=0.512; 95%CI 0.300～0.875;P=0.014)是SCLC患者PFS的獨立危險因素；NSE<35ng/mL(HR=2.676; 95%CI 1.377～5.200;P=0.004)，Ki67在腫瘤組織中的陽性細胞數(shù)≤60%(HR=2.199; 95%CI 1.038～4.661;P=0.040)， 年齡<70歲(HR=2.206； 95%CI 1.127～4.318；P=0.021)是SCLC患者OS的獨立預(yù)后因素；腫瘤分期早和規(guī)律化療是PFS和OS的獨立預(yù)后因素(P<0.001)(見表2)。

表2 SCLC中PFS和OS相關(guān)因素的Cox風(fēng)險回歸模型多因素分析

討 論

與非小細胞肺癌相比，小細胞肺癌發(fā)現(xiàn)晚，治療方案有限，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，大部分患者預(yù)后較差。且目前臨床預(yù)測SCLC預(yù)后的生物學(xué)標志物有限。DLL3作為Notch信號通路的抑制性配體，已有文獻報道DLL3與部分腫瘤增殖和侵襲相關(guān)，且影響腫瘤預(yù)后[19-20]，但目前關(guān)于DLL3與SCLC的預(yù)后關(guān)系的研究尚少，本研究中我們發(fā)現(xiàn)DLL3在84.5%的SCLC腫瘤組織中表達，定位于細胞膜，與年齡、性別、腫瘤直徑、分期等均無關(guān)，與日本的一項研究結(jié)果是一致的[18]，但與血清NSE表達呈正相關(guān)(P<0.05)。且發(fā)現(xiàn)DLL3高表達患者的PFS短于低表達組，而總生存期無顯著差異，因此單一的DLL3蛋白表達可能無法有效評估SCLC的預(yù)后。已有文獻報道血清NSE可用于評估腫瘤預(yù)后，但NSE水平受多種因素干擾，多種標志物聯(lián)合可能有助于提高對預(yù)后的預(yù)測價值，因此我們首次將腫瘤組織中DLL3表達水平與治療前血清NSE表達水平聯(lián)合用于評估SCLC患者預(yù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLL3低表達且血清NSE<35ng / L的患者具有更長的生存期。因此DLL3聯(lián)合NSE可用于評估SCLC患者的預(yù)后。此外，我們還探究其他因素對SCLC患者生存的影響，結(jié)果表明腫瘤分期早及規(guī)律化療可改善SCLC的預(yù)后，但此項研究是單中心的、樣本量相對較少，且腫瘤分期多為Ⅲ/Ⅳ期，缺乏I/II期患者，不可避免的存在選擇偏倚，且本實驗檢測DLL3表達時采用的是免疫組化方法，此方法受實驗者技術(shù)水平的影響，結(jié)果判斷方面具有一定的主觀性。SCLC患者的預(yù)后受多種因素的影響，存在個體差異性，部分患者可能為非腫瘤性死亡，影響最終結(jié)果的判斷，因此，需要更多的前瞻性、多中心、大樣本的臨床試驗進一步驗證本試驗結(jié)果。

結(jié) 論

DLL3表達雖與SCLC患者總生存期無明確相關(guān)性，但與無進展生存期相關(guān)，因此DLL3表達聯(lián)合治療前血清NSE有助于評估晚期SCLC患者預(yù)后。