林長松，邵嬌芳，武 劍，汪強虎

（南京醫(yī)科大學(xué) 江蘇 南京 211166）

近些年興起的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)成為生物醫(yī)藥研究中的一把利劍，在研究腫瘤異質(zhì)性，發(fā)育等方面起著重要的作用，是生物信息學(xué)本科生教學(xué)中不可或缺的一塊內(nèi)容。然而單細胞轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，從下機數(shù)據(jù)處理到后續(xù)分析也是異常復(fù)雜，并且分析環(huán)境也多種多樣，極大地增加了教學(xué)難度，因此需要老師對整塊教學(xué)內(nèi)容進行有效編排。

1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序教學(xué)所面臨的問題

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是一門新興學(xué)科，不單單是轉(zhuǎn)錄組測序的延續(xù)，目前國內(nèi)很少學(xué)校開設(shè)該課程[1-3]。教學(xué)中面臨的兩大問題：①單細胞轉(zhuǎn)錄組分析環(huán)境復(fù)雜，涉及眾多R 包和python 軟件包，分析環(huán)境難以配置，學(xué)生需要耗費大量時間用以配置分析環(huán)境，是學(xué)習(xí)單細胞轉(zhuǎn)錄組過程中主要的障礙；②涉及眾多知識點，學(xué)生容易掌握單個知識點，但難以融會貫通，串成一根主線，分析完整的案例時顯得力不從心；如果老師繼續(xù)使用傳統(tǒng)的講授方式，學(xué)生無法產(chǎn)生學(xué)習(xí)興趣，對單細胞轉(zhuǎn)錄組測序內(nèi)容難以理解，并且學(xué)生不能理解單細胞轉(zhuǎn)錄組測序這門課設(shè)置的目的與意義，無法激發(fā)學(xué)好一門學(xué)科應(yīng)該有的積極性，因此恰當?shù)慕虒W(xué)方式就顯得尤為重要。于是，在此情形下，突破傳統(tǒng)的大課堂，導(dǎo)入其他教學(xué)模式是極為必要的。為了解決配置環(huán)境方面的問題，引入容器化技術(shù)，基于singularity 構(gòu)建單細胞分析的R 環(huán)境容器文件以及shell 環(huán)境下的容器文件，徹底解決單細胞轉(zhuǎn)錄組分析環(huán)境的軟件配置難題。在教學(xué)方法上，采用問題導(dǎo)向式學(xué)習(xí)(problem-based learning，PBL)教學(xué)方法，將完整的案例穿插在單個知識點的教學(xué)中，引導(dǎo)學(xué)生運用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析方法對科學(xué)問題進行探索[4]。

2 基容器化技術(shù)在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序中的應(yīng)用

當前部署生物信息分析平臺常借助于容器化技術(shù)：

①借助于conda 軟件安裝生物信息分析軟件，可以將單個的生物信息分析軟件安裝在獨立的虛擬環(huán)境中，也可以將多生物信息分析軟件安裝在一個conda環(huán)境，但conda軟件會安裝額外的環(huán)境所需軟件，環(huán)境臃腫，安裝時受網(wǎng)速影響很大，另外不便于跨平臺移植使用[5-6]；②docker 是一種輕量級的虛擬化技術(shù)，在生物信息學(xué)中使用廣泛[7]。docker 可為單一的生物信息學(xué)分析流程建立一個可移植的容器，并且在該容器內(nèi)可以放置分析代碼，配置文件，而當前在很多生信公司中使用成熟的代碼進行規(guī)范化分析時多使用docker 技術(shù)[8-9]。docker hub 網(wǎng)站中也有單細胞分析所需的docker鏡像，但在教學(xué)中，有一致命性缺陷，即運行時需要服務(wù)器的root 權(quán)限，增加了服務(wù)器的不安全性，而且不好修改，不便于實際中使用；③近些年隨著超算興起的singularity 軟件，和docker 軟件的功能很類似，卻不需要root 權(quán)限，在生信領(lǐng)域具有很廣闊的使用前景。相較于docker，singularity 有獨特的優(yōu)勢：容易對分析環(huán)境進行打包遷徙，和現(xiàn)有系統(tǒng)無縫整合，無須運行daemon 進程，支持多種鏡像和容器文件格式，易于和現(xiàn)有的超算系統(tǒng)整合，國內(nèi)多個超算平臺已部署singularity 軟件，并且可以使用singularity pull 命令獲取docker 資源。另外，在教學(xué)中融入構(gòu)建singularity 容器的內(nèi)容，使學(xué)生從底層掌握容器構(gòu)建過程，提高他們的科研技能。

3 基于容器化技術(shù)構(gòu)建單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析軟件

穩(wěn)定的生物信息學(xué)分析軟件環(huán)境不僅是教學(xué)的需要，同樣也是科研之必需。在教學(xué)中采用的策略是：linux 基礎(chǔ)一般的學(xué)生掌握容器化軟件的使用，了解容器化軟件的構(gòu)建流程，而學(xué)有余力的學(xué)生可以掌握容器化軟件的構(gòu)建過程，圖1 所示搭建單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析軟件，具體構(gòu)建過程如下：①下載純凈版的Ubuntu（版本18.0.6），構(gòu)建沙盒，設(shè)置沙盒的讀寫屬性，安裝常見的庫文件，將linux shell環(huán)境中使用的軟件Sratools（sra 文件下載及轉(zhuǎn)換），Samtools（sam/bam 文件操作），Cellranger（單細胞測序文件比對），cellphonedb（python 環(huán)境下的細胞通訊分析軟件），velocyto（python 環(huán)境下的RNA 速率分析軟件），pySCENIC（python 環(huán)境下的單細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控軟件）軟件安裝在純凈的Ubuntu 操作系統(tǒng)中，打包封裝成是以sif 結(jié)尾的singularity 容器文件。②R 包分析環(huán)境的構(gòu)建：在純凈的ubuntu環(huán)境中裝R 所需的庫文件，然后裝R-base 軟件（版本4.0.6），接著將單細胞分析的R 包都安裝在該環(huán)境下，安裝過程中需要安裝眾多依賴的庫文件，安裝完成后封裝成是以sif 結(jié)尾的singularity 文件。該R 包分析環(huán)境主要涉及以下R 包軟件：數(shù)據(jù)讀入整合R 包（Seurat，harmony）；雙細胞鑒別R 包（DoubletFinder）；細胞亞群識別(scMCA，scHCL，singleR)；細胞通訊（iTALK，Nichenet，CellChat）；CNV的推斷（inferCNV，copyKAT）；軌跡分化（velocyto.R，Monocle2，Monocle3）；轉(zhuǎn)錄調(diào)控（SCENIC）；功能化分析（clusterprofiler，org.Hs.eg.db，GSVA），以上R 包能夠滿足本科生單細胞轉(zhuǎn)錄組測序課程的教學(xué)。

圖1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析環(huán)境的容器化軟件

4 PBL 教學(xué)法與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

4.1 PBL 教學(xué)法的特征及優(yōu)勢

從教育心理學(xué)的定義來看，問題本身可分為結(jié)構(gòu)良好問題和結(jié)構(gòu)不良問題。單細胞轉(zhuǎn)錄組教學(xué)中的案例教學(xué)內(nèi)容問題就屬于后者，適用于PBL 中的案例教學(xué)，其被解決的過程和可能的答案常常不具有規(guī)律性和穩(wěn)定性，即新的問題不能按部就班照著舊的問題的解決方法去處理，因此這種教學(xué)方式不是枯燥且一成不變地學(xué)，而是基于真實情景的問題，以解決問題為起點，從問題出發(fā)延伸，從而對知識進行探索、掌握中心分析與理解運用，是一種“高水平學(xué)習(xí)”[10]。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析這門課要求學(xué)生理清并掌握概念間的各式復(fù)雜聯(lián)系，學(xué)以致用，且因事制宜，運用到具體的科學(xué)問題（肺腺癌的異質(zhì)性）中去。而逐漸掌握的過程也是從案例問題中學(xué)習(xí)的過程；運用的過程則對應(yīng)著加強理解的過程，并能檢驗掌握程度。正如實踐是認識的唯一來源，也是目的和歸宿。因此，問題的發(fā)現(xiàn)者即學(xué)生，是PBL 教學(xué)的主體與核心[11]。因此，PBL 教學(xué)對于生物信息學(xué)專業(yè)本科學(xué)生將來的學(xué)習(xí)和工作的能力塑造至關(guān)重要。

4.2 學(xué)生的主體地位

傳統(tǒng)的教學(xué)方法更傾向于授人以“魚”，雖一直提倡學(xué)習(xí)是學(xué)生自己的事，但在現(xiàn)當代的填鴨式教育模式下，老師在教學(xué)中處于主體地位，通常是學(xué)生學(xué)了什么取決于老師教了什么，PBL 教學(xué)法則傾向于授人以“漁”，其差別便在于將從教為中心翻轉(zhuǎn)為了以學(xué)生自主學(xué)為中心[12]。本課程中老師的作用相當于其中的“根節(jié)點”，給學(xué)生提供一個綜合的框架或者一個問題，學(xué)生根據(jù)老師提供的框架和問題，通過自身對資料的查閱來解決問題，其過程本身則更傾向于對問題的探尋，而不是拘泥于那“正確”的答案。由此不難看出，學(xué)生在這種學(xué)習(xí)模式當中占據(jù)了主體地位，問題導(dǎo)向式學(xué)習(xí)的過程也極大地增加了學(xué)生學(xué)習(xí)的自主性和去盲從性，脫離了無意義的“死記硬背”，激發(fā)學(xué)生的求知欲，活躍其思維，迸發(fā)出更多的“頭腦風暴”。

4.3 教師的指導(dǎo)者角色

傳統(tǒng)的教學(xué)模式中，教師是“灌輸式教育”的主導(dǎo)者，而在PBL 教育模式當中，教師是學(xué)生獲得知識的教練，即“教”學(xué)生如何自主達到“練”的目的。教師和學(xué)生之間構(gòu)成了一種新型的關(guān)系，從只教與學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)作關(guān)系。所謂“協(xié)作”，即教師與學(xué)生的關(guān)系是平等的，其通過共同的合作達到所設(shè)定的目標。傳統(tǒng)教學(xué)當中，教師的身份大多數(shù)“替代”了學(xué)生一職，鼓勵學(xué)生提出問題無錯之有，不恰當?shù)氖枪膭顚W(xué)生提出問題之后，并未鼓勵其自己解決，教師反倒成了“學(xué)生”，鉆研出成果之后直接告訴學(xué)生，學(xué)生只知其結(jié)果而不知探求的過程之樂[13]。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序課程中教師應(yīng)當發(fā)揮“教”的長處，滲透了“一葉黃而知天下秋”的教育理念，給學(xué)生提供一“點”供其發(fā)展為一“面”，并在學(xué)生毫無頭緒或與所達目的有所偏差的情況下參與討論，提點其一二，充當學(xué)生獲得知識的教練和指導(dǎo)者的同時，給學(xué)生最大的發(fā)揮空間。至此，一貫盛行的教師應(yīng)當講滿課程、充分利用好一節(jié)課的每一分鐘的觀點則不攻自破，一幅好的畫須“留白”，教學(xué)亦如此，在本課程中教師的身份很好地詮釋了“留白”的作用，留白才可供學(xué)生發(fā)揮。誠然，新的教育模式也需要教師具備更高水平的、多學(xué)科的專業(yè)知識、專業(yè)技能，才能有足夠的能力給予學(xué)生幫助，所謂教學(xué)相長，應(yīng)是如此。

5 PBL 教學(xué)法在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序教學(xué)中的實施

5.1 單個知識點的內(nèi)容講解

采用理論課和實驗課相結(jié)合的方式介紹單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的基本知識，讓學(xué)生從宏觀角度對單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)有初步的認識，以及每個細小問題的分析方法。主要涉及數(shù)據(jù)讀入，整合、雙細胞鑒別；細胞亞群識別；細胞通訊；CNV 的推斷；軌跡分化；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；功能化分析。

5.2 教師根據(jù)學(xué)習(xí)大綱設(shè)計并提出問題

完整的案例是以O(shè)ncogene 雜志中Single-cell RNA sequencing reveals distinct tumor microenvironmental patterns in lung adenocarcinoma 這一文章為基礎(chǔ)，提出的問題為：如何用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索肺腺癌的異質(zhì)性。圍繞這一主要問題衍生出子問題：①腫瘤的異質(zhì)性是什么，如何用分析結(jié)果展示；②多樣本數(shù)據(jù)怎么整合；③如何注釋肺腺癌微環(huán)境中多種細胞；④肺腺癌微環(huán)境中多種細胞的細胞間通訊如何；⑤如何鑒定肺腺癌腫瘤細胞；⑥細胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中核心的轉(zhuǎn)錄因子是哪些？⑦肺腺癌微環(huán)境中多種細胞的分化軌跡是什么。立足于原文，但又不限于原文，根據(jù)這些子問題對原始數(shù)據(jù)進行重新分析。

5.3 以小組為單位的討論與分析

我們將學(xué)生分成不同小組，由小組長牽頭，討論以上的子問題，確定分析思路，并將上課時學(xué)到的零碎知識點串聯(lián)起來，組織代碼，加以分析。在實際運行中遇到的困難在小組群中加以討論。

5.4 集中討論

對于實際分析過程中遇到的學(xué)生迷惑的知識點采用集中討論的方式，其中重點突出的問題有“如何鑒定肺腺癌腫瘤細胞”及“分析軌跡分化的多個軟件比較”。通過集中討論的方法有效地解決了學(xué)生的困惑，第一個問題是“如何鑒定肺腺癌腫瘤細胞”，經(jīng)過討論給出的解決方案：鑒定腫瘤細胞類型的方法是借助inferCNV 和標記基因兩種方法。第二個問題是“分析軌跡分化的多個軟件比較”，經(jīng)過大家討論給出的解決方案：Monocle2，SlingShot 及PAGA等軟件結(jié)果需同RNA 速率軟件結(jié)果結(jié)合，軟件的選擇取決于數(shù)據(jù)及真實的生物學(xué)意義。

5.5 課程考核

以小組為單位展示本小組的分析結(jié)果，采用PPT 展示和小論文形式，PPT 展示分析的過程及思路，論文中展示詳細的代碼及處理過程。熟悉該領(lǐng)域的3 位老師對每一小組的匯報結(jié)果進行打分，取平均分，該部分占總成績的40%。

6 總結(jié)

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)課程中使用基于容器化技術(shù)部署生物信息學(xué)軟件和問題導(dǎo)向式學(xué)習(xí)在單細胞轉(zhuǎn)錄組測序課程教學(xué)中的應(yīng)用案例，從基礎(chǔ)、理論、實踐三方面的學(xué)習(xí)，提高實際科學(xué)問題中的數(shù)據(jù)分析能力，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)潛能，為他們的數(shù)據(jù)分析及科研奠定良好的基礎(chǔ)。