張寶軍， 張 磊， 王健英

(上海中醫(yī)健康服務協(xié)同創(chuàng)新中心/上海中醫(yī)藥大學， 上海 201203)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides) 的干燥葉, 性溫, 味微辛, 具有補肝腎、 強筋骨的功效,可用于治療肝腎不足、 頭暈目眩、 腰膝酸痛、 筋骨痿軟等癥狀[1]。 現(xiàn)代藥理研究表明, 杜仲葉富含黃酮類、 環(huán)烯醚萜類、 苯丙素類、 木脂素類、 酚類、 杜仲膠、 多糖類等化學成分[2], 具有免疫調節(jié)、 降脂降糖、 抗衰老、抗氧化、 抗炎、 抗骨質疏松等多種保健作用[3]。 2019年國家衛(wèi)生健康委同國家市場監(jiān)管總局將杜仲葉列入黨參等9 種試點按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質名單[4], 作為一種藥食同源物質, 歷年來杜仲葉已廣泛應用于功能性健康食品領域, 相關產品種類繁多, 諸如杜仲葉復合保健飲料[5]、 發(fā)酵醋[6]、 保健牙膏[7]、 超微粉饅頭[8]、 茶飲[9]等。 目前, 杜仲葉的研究主要集中在某一類成分的提取分離、 質量控制、 含量測定、 動物實驗等方面, 杜仲葉相關健康產品的研究更偏向于制備工藝方面, 然而從分子水平系統(tǒng)闡述杜仲葉整體營養(yǎng)功能及評價的研究鮮有報道, 在一定程度上限制了其新型食品資源的開發(fā)與利用。 網絡藥理學作為一種有效預測藥物靶點和分子機制的分析手段, 因其整體性、 系統(tǒng)性和綜合性的屬性特征與中藥多成分、 多靶點、 整體性的特點具有高度的相似性[10], 目前已廣泛應用于食品、 藥品領域。 本研究運用網絡藥理學研究方法, 對杜仲葉潛在關鍵靶點及信號通路進行挖掘分析, 探討杜仲葉營養(yǎng)價值與作用機制, 以期為杜仲葉藥食同源類健康產品的開發(fā)提供理論依據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 杜仲葉化合物信息及潛在靶點的獲取

基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺TCMSP(https: / /www.tcmsp-e.com/) 檢索, 以“杜仲葉” 為關鍵詞, 獲取杜仲葉化合物成分信息及對應的潛在靶點, 結合Uniport 數(shù)據庫(https: / /www.uniprot.org/),將靶點名稱轉化為對應的基因名, 形成化合物-基因對應關系, 以便后續(xù)分析。

1.2 蛋白質作用網絡(PPI) 的構建與分析

通過在線STRING 數(shù)據庫平臺(https: / /cn.stringdb.org/, 版本號11.5), 以物種設置為“Homo sapiens”, 最高置信度蛋白交互參數(shù)評分值0.9 作為初始條件, 導入243 個靶點, 去掉網絡中離散的節(jié)點構建PPI網絡圖。 將PPI 數(shù)據導入Cytoscape 3.8.2 軟件中, 通過“Network Analyzer” 功能進行靶點拓撲屬性分析。

1.3 基因功能富集分析

利用DAVID 數(shù)據庫(https: / /david.ncifcrf.gov/)及KEGG 數(shù)據庫(https: / /www.kegg.jp/kegg/) 進行GO 富集和KEGG 通路富集分析243 個基因靶點信息。

1.4 “化合物-靶點-通路” 網絡的構建與分析

運用Cytoscape 可視化網絡繪圖軟件, 繪制杜仲葉化合物-靶點-通路網絡, 并獲取相關網絡參數(shù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉化合物信息數(shù)據庫的構建

通過TCMSP 數(shù)據庫檢索到78 個化合物成分及289個對應潛在靶點, 去除數(shù)據庫中無靶點及非人源靶點對應化合物信息, 經uniport 數(shù)據庫轉化為基因名去重后,共得53 個化合物信息對應243 個基因靶點, 杜仲葉關鍵化合物信息見附表。

附表 杜仲葉關鍵化合物信息

2.2 杜仲葉化合物作用靶點相互作用網絡分析

通過在線STRING 數(shù)據庫, 導入243 個靶點構建PPI 網絡圖, 拓撲屬性分析結果顯示, 網絡中包含186個節(jié)點, 731 條邊。 以連接度(degree) 值為參考, 排名前10 的靶點分別為SRC (degree ＝39)、 TP53 (degree ＝37)、 AKT1 (degree ＝36)、 MAPK1 (degree ＝35)、 MAPK3 (degree ＝35)、 RELA (degree ＝35)、 TNF(degree ＝27)、 FOS (degree ＝25)、 RXRA (degree ＝24)、 IL6 (degree ＝24), 其中度值最高的SRC 能與39個蛋白發(fā)生相互作用, 預示著這些靶點可能是杜仲葉作為藥食兩用物質, 發(fā)揮營養(yǎng)價值和保健功效的潛在關鍵蛋白, 蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網絡見圖1。

圖1 蛋白-蛋白相互作用(PPI) 網絡

2.3 基因功能GO 富集分析

以P<0.05、FDR<0.05 為篩選條件, 物種設置為“Homo sapiens”, 在“Gene Ontology” 項下, 在DAVID數(shù)據庫中GO 富集分析243 個作用靶點, 結果顯示, GO條目包含424 個生物過程(biological process, BP), 主要涉及基因表達的正調控、 藥物反應、 細胞增殖的正調控、 對外源刺激的反應、 衰老、 對脂多糖的反應、 對缺氧的反應、 絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應的正調控、 對乙醇的反應、 細胞對鎘離子的響應等過程。 94 個細胞組成(cellular component, CC) 主要富集在細胞外間隙、 質膜、 細胞小凹、 突觸后膜、 質膜的整體成分、 胞外區(qū)、 膜筏、 大分子復合物、 細胞表面等區(qū)域。 94 個分子功能(molecular function, MF) 條目, 主要富集在酶結合、 相同的蛋白質結合、 蛋白質同源二聚體化活性、遞質門控離子通道活性參與突觸后膜電位的調節(jié)、 興奮性細胞外配體門控離子通道活動、 神經遞質受體活性、RNA 聚合酶II 轉錄因子活性, 配體激活序列特異性DNA 結合、 蛋白結合、 胞外配體門控離子通道活性、 蛋白激酶活性等功能。 根據P值, 分別選取BP、 CC、 MF排名前10 的條目(圖2)。

圖2 GO 功能富集分析柱狀圖

2.4 KEGG 通路富集分析

以P<0.05、FDR<0.05 為篩選條件, 對上述243個作用靶點進行KEGG 通路富集分析, 共得到186 個條目, 主要涉及腫瘤通路、 脂質與動脈粥樣硬化、 人類巨細胞病毒感染、 卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、 流體剪切應力與動脈粥樣硬化、 乙型肝炎、 糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、 前列腺癌、 胰腺癌、 膀胱癌信號通路等。 選取排名前20 的通路進行KEGG 通路富集分析氣泡圖繪制(圖3), 圓點越大表示富集的基因數(shù)越多； P 值越小, 圓點顏色越藍； P 值越大, 圓點顏色越黃。 以富集基因數(shù)最多的腫瘤通路為例, 結合KEGG Pathway 數(shù)據庫, 標注66 個涉及靶點在通路上的相關調控過程, 相關靶點調控過程用藍色標識, 其中排名前10靶點涉及調控過程用紅色標識, 杜仲葉營養(yǎng)成分對腫瘤通路的作用靶點標注圖見圖4。

圖3 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖4 杜仲葉營養(yǎng)成分對腫瘤通路的作用靶點標注圖

2.5 杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網絡的構建及分析

KEGG 通路富集分析排名前10 通路及其涉及的96個靶點和靶點對應的34 個成分導入Cytoscape 軟件中,構建杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網絡(圖5)。 根據拓撲分析, 網絡中化合物連接度值越大意味著其對應的靶點越多, 以連接度(degree) 值為參考, 排名前5 的化合 物 依 次 為 MOL000098 槲 皮 素 (degree ＝80)、MOL000422 山 奈 酚 (degree ＝25)、 MOL000415 蘆 丁(degree ＝9)、 MOL003735 桃葉珊瑚苷(degree ＝8)、MOL000123 牻牛兒醇(degree ＝6), 在網絡中具有較高的連接度表明, 這些成分可能是杜仲葉發(fā)揮藥效的潛在活性物質； 以≥2 倍中位數(shù)的degree 值(degree 中位數(shù)值為5) 進行篩選, 排名前10 的靶點分別為PTGS2(degree ＝32)、 RELA (degree ＝13)、 F2R (degree ＝12)、 TNF (degree ＝11)、 AKT1 (degree ＝11)、 TP53(degree ＝10)、 MAPK3 (degree ＝10)、 MAPK1 (degree＝10)、 BCL2 (degree ＝10)、 BAX (degree ＝10), 預示著這些靶點在相關通路上發(fā)揮著重要的作用。

圖5 杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網絡

3 討論

近年來, 網絡藥理學已廣泛應用于食品科學領域分析, 為營養(yǎng)成分的功能定位提供了科學依據。 現(xiàn)代藥理學研究表明, 應劍等[11]利用網絡藥理學方法通過建立“成分-靶標-疾病” 的關聯(lián)網絡, 闡述了蜂膠成分改善代謝性疾病的“多成分、 多靶點” 特征, 分析了核心作用通路。 黃旭龍等[12]通過網絡藥理學的方法, 篩選了8個西瓜皮活性營養(yǎng)成分, 并對糖尿病防治潛在作用靶點和通路進行了預測分析, 為西瓜皮藥用價值的研究和資源開發(fā)提供了參考。 安莉等[13]基于生物信息學探討了山藥的營養(yǎng)藥理功能及作用機制, 分析挖掘了其潛在關鍵靶點及關鍵代謝途徑。 為了更好地明確杜仲葉營養(yǎng)價值的功能定位, 探討其對人體作用機制的重要意義, 本文通過網絡藥理學, 探討了杜仲葉的營養(yǎng)價值功能與作用機制。

通過杜仲葉靶點蛋白PPI 網絡圖分析, 篩選出degree 值≥35 的潛在關鍵靶點, 具體包括SRC、 TP53、AKT1、 MAPK1、 MAPK3、 RELA。 SRC 作為一類重要的非受體酪氨酸蛋白激酶, 在胰腺癌、 肺癌、 前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展中發(fā)揮著重要作用, 如參與細胞增殖、 凋亡、 轉移、 影響細胞連接和粘附、 血管生成、 細胞周期和信號通路等多個方面[14-15]。 TP53作為一種重要的抑癌基因, 基因狀態(tài)的改變可誘導腫瘤的發(fā)生, 在基因網絡調控中發(fā)揮重要的作用, 其編碼的多功能的轉錄調節(jié)因子可參與調節(jié)細胞周期、 修復DNA損傷及促進細胞的程序性凋亡[16-17], 此外TP53 的基因狀態(tài)也是判斷淋巴瘤和血液病預后的重要指標[18], 可通過其突變情況, 指導臨床用藥和治療方案的選擇。 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT 為磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K) 下游的重要靶點, 其參與PI3K/Akt 信號通路在抑郁 癥[19]、 糖 尿 病[20]、 心 血 管 疾 病[21]、 腦 神 經 疾病[22]、 高血壓[23]防治過程中扮演著重要角色。

杜仲葉“化合物-靶點-通路” 網絡分析顯示, 黃酮類(槲皮素、 山奈酚、 蘆丁)、 環(huán)烯醚萜類(桃葉珊瑚苷)、 單萜類(牻牛兒醇) 可能是其發(fā)揮營養(yǎng)功能的重要化合物。 研究表明, 槲皮素作為一種具有廣闊應用前景的天然膳食化合物, 在疾病預防及治療方面具有廣泛的藥理作用, 近年來因其在抗糖尿病、 抗氧化、 抗高血壓病、 抗炎、 抗菌、 抗衰老及心血管保護方面的重要藥用價值而備受關注[24-25]。 山奈酚具有豐富多樣的生物學活性, 其功能涉及癌癥、 糖尿病、 骨質疏松、 動脈粥樣硬化、 保護神經以及抑制蛋白激酶等多個方面, 還可作為食品加工中的防腐保鮮劑及抗氧劑[26]。 研究表明,蘆丁是一種天然抗氧化劑, 具有心血管保護、 神經保護、 抗炎、 抗菌、 抗腫瘤等生物活性, 其多種藥理作用的發(fā)揮與其抗氧化性和抗炎活性有著密切的關系[27-29],此外蘆丁還是一種具有顯著護肝生物活性的重要藥膳兩用功能成分[30]。 桃葉珊瑚苷可通過調節(jié)Nrf2、 NF-κB、AMPK、 NO、 JNK 等多條信號通路, 發(fā)揮神經和生殖系統(tǒng)保護、 降低血糖水平、 抗骨關節(jié)炎、 抗骨質疏松、 抗腫瘤以及抗老化等藥理作用[31], 此外桃葉珊瑚苷經人腸道菌群代謝后, 其苷元是起解毒保肝作用的主要活性形式[32], 具有顯著的抗菌作用, 且活性優(yōu)于桃葉珊瑚苷[33]。 牻牛兒醇又名香葉醇, 具有改善糖脂代謝異常及血管內皮功能障礙、 抑制細胞氧化應激反應、 抗炎、調節(jié)血膽固醇等藥理作用, 在心血管疾病防治方面具有廣闊的應用前景[34-35]。 由此可見, 杜仲葉中富集靶點較多的這些化合物在抗炎、 抗腫瘤、 抗氧化、 心血管保護等方面發(fā)揮著重要的營養(yǎng)保健功能。

4 結論

本研究通過網絡藥理學方法探討了杜仲葉營養(yǎng)價值功能及生物學機制, 通過構建“化合物-靶點-通路” 網絡, 分析挖掘了具備營養(yǎng)功能重要化合物的潛在靶點及作用通路, 結果顯示出杜仲葉具有抗炎、 抗腫瘤、 抗氧化、 心血管保護等功效, 揭示了其多成分、 多靶點、 多途徑協(xié)同作用的特點, 為后續(xù)杜仲葉產業(yè)化開發(fā)奠定了理論基礎, 對其藥食同源類功能產品的開發(fā)提供了良好的基礎和科學指導。