黃嘉，劉沖，佘瑛潔，劉欣琪，劉永萍，張?zhí)炝粒邴悺?/p>

（1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；3濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊 261053）

大氣顆粒物（particulate matter，PM）是衡量大氣污染的重要標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，目前世界上90%以上的人口依然生活在超出標(biāo)準(zhǔn)的污染地區(qū)。PM2.5（環(huán)境中空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm的顆粒物）因其特殊的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，因而其表面易攜帶大量有害元素和有毒有機(jī)物。暴露于PM2.5會引起包括氧化應(yīng)激、炎癥、DNA損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)的多種機(jī)制改變，造成機(jī)體損傷［1-3］。居民生活在空氣污染較嚴(yán)重的區(qū)域出現(xiàn)精神疾病癥狀的風(fēng)險更高，而空氣污染對孕婦的精神狀況影響尤為明顯。孕婦屬于非常脆弱的群體，整個妊娠期都處于情緒特別不穩(wěn)定的狀態(tài)，是抑郁癥發(fā)生的潛在風(fēng)險人群［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以通過血液從肺部到達(dá)大腦，而腦內(nèi)顆粒物的清除相較于機(jī)體其他器官更慢、更困難，腦內(nèi)的顆粒物可以對腦組織及其周圍細(xì)胞帶來更持久的毒性作用［5］。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計，環(huán)境中PM2.5每增加10μg/m3就會增加5.1%認(rèn)知功能不良的風(fēng)險；PM2.5暴露量增加1μg/m3會導(dǎo)致認(rèn)知反應(yīng)時間延長2%［6-7］；妊娠期間母親PM2.5暴露量在16.4～29.3μg/m3將會增加83%的產(chǎn)后抑郁風(fēng)險［8］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，妊娠期暴露于高濃度PM2.5環(huán)境會導(dǎo)致孕鼠中樞性系統(tǒng)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，B族維生素（B vitarnins，VitB）干預(yù)可以在一定程度抑制大腦皮層炎癥通路的激活［9-10］。但環(huán)境污染導(dǎo)致孕婦精神變化的確切機(jī)制尚不清晰。

環(huán)境損傷和遺傳因素均可導(dǎo)致個體的認(rèn)知和情緒問題，而表觀遺傳則可能是兩者的中介［11-12］。文獻(xiàn)表明，組蛋白去甲基化酶KDM5家族成員在精神疾病和認(rèn)知障礙中表達(dá)下降，KDM5家族調(diào)控組蛋白H3第4位賴氨酸（histone H3 lysine 4，H3K4）的去甲基化，而H3K4則與認(rèn)知和精神疾病高度相關(guān)［13］。因此，我們擬進(jìn)一步探究KDM5家族在B族維生素干預(yù)PM2.5致孕鼠抑郁樣行為中的表達(dá)變化，并從表觀遺傳學(xué)角度探討B(tài)族維生素改善PM2.5誘發(fā)孕鼠抑郁樣行為的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物SPF級ICR小鼠，8～9周齡，體重（28±2）g，購于山東省濟(jì)南實驗動物中心，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。運(yùn)輸至實驗環(huán)境后適應(yīng)1周。飼養(yǎng)條件：自由飲水進(jìn)食，室溫25℃左右。將雌雄小鼠按2∶1的比例合籠，次日雌鼠查出陰栓者即為妊娠第1天。

1.2 主要材料與試劑維生素B6、維生素B12和葉酸均購自Sigma；BCA蛋白濃度測定試劑盒、PCR Master Mix、蛋白預(yù)染Marker和ECL發(fā)光試劑盒均購自Thermo Scientific；Hoechst、PMSF和RIPA裂解液均購自Solarbio；Trizol購自Invitrogen；SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa；兔KDM5A、KDM5B、KDM5C、H3K4me3和突觸小泡蛋白（synaptophysin，SYP）單克隆抗體，兔生長相關(guān)蛋白43（growth-associated protein-43，GAP-43）多克隆抗體，鼠神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）和β-actin單克隆抗體均購自Abcam；兔突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自Proteintech；KDM5A、KDM5B、KDM5C及β-actin的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

1.3 主要儀器SMARTV 3.0小動物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)（Panlab）；NanoDrop 2000c核蛋白分析儀（Thermo）；基因擴(kuò)增儀ProFlex PCR型（Life Technologies）；CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；肺部液體定量霧化器（北京慧榮和科技有限公司）。

2 主要方法

2.1 PM2.5懸液的制備使用大氣顆粒物采樣器，收集2019年12月～2020年1月采暖季某地級市城區(qū)大氣PM2.5。將顆粒物過濾膜切成小塊，在低溫下用去離子水處理。超聲波振蕩4次（每次30 min）。然后收集洗脫液并在真空中冷凍干燥，將冷凍干燥的粉末保存在-20℃。以PBS為溶劑配成懸濁液，按照冬季地區(qū)PM2.5最高值1 000μg/m3，轉(zhuǎn)換為小鼠體重則為20.736μg/kg。

2.2 PM2.5暴露模型的制備與分組 查出陰栓后，將共計39只的孕鼠隨機(jī)分為對照（control）組、PM2.5組和PM2.5+VitB組，查出陰栓的當(dāng)天記為E0。PM2.5暴露組：采用負(fù)壓噴霧裝置，使用氣管霧化的方式給予PM2.5暴露，每3 d一次（即E0.5、E3.5、E6.5、E9.5、E12.5和E15.5），每 次50μL PM2.5混懸液，整個孕期共6次；對照組：氣管霧化給予等量0.01 mol/L PBS；B族維生素干預(yù)組：氣管霧化給予相同劑量的PM2.5混懸液，30 min后進(jìn)行B組維生素（葉酸0.6 mg·kg-1·d-1，維生素B6 11.4 mg·kg-1·d-1，維生素B12 0.2 mg·kg-1·d-1）灌胃，B族維生素混合液的制備參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)將人的劑量等效換算為小鼠［14］，從妊娠期第1天開始每天進(jìn)行灌胃（E0.5～E17.5）。妊娠結(jié)束后的第14天，孕鼠進(jìn)行行為學(xué)測試；分離其大腦皮層，分別用于分子生物學(xué)檢測、免疫熒光染色和高爾基染色，相關(guān)流程見圖1。

Figure 1.Schedule of treatment and behavioral tests in mice models.圖1 孕鼠模型建立和相關(guān)實驗時間表

2.3 曠場實驗（open-field test，OFT）孕鼠妊娠結(jié)束后的第14天進(jìn)行曠場實驗，將其置于實驗箱（40 cm×40 cm×35 cm）的中心位置，然后使用Smart V3.0智能視頻跟蹤系統(tǒng)記錄母鼠5 min內(nèi)的探索軌跡和行為學(xué)參數(shù)，包括總運(yùn)動距離及在中心區(qū)域（20 cm×20 cm）的移動距離和時間。

2.4 RT-qPCR實驗大腦皮層勻漿，Trizol試劑提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄。使用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。在CFX-manager 3.1系統(tǒng)上，使用SYBR預(yù)混料Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR實驗。采用2-ΔΔCt法測定mRNA的變化，β-actin為內(nèi)參照，KDM5A、KDM5B和KDM5C的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)參考之前的程序進(jìn)行［15］，各引物序列詳見表1。

2.5 Western blot大腦皮層組織加入RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，行10%SDSPAGE。300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ抗孵育4℃過夜：兔源KDM5A單克隆抗體（1∶5 000），兔源KDM5B單克隆抗體（1∶1 000），兔源KDM5C單克隆抗體（1∶1 000），兔源H3K4單克隆抗體（1∶1 000），兔源SYP單克隆抗體（1∶20 000），兔源PSD95單克隆抗體（1∶1 000），兔源GAP-43多克隆抗體（1∶1 000）。TBST洗滌10 min×3次，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次。最后加入ECL發(fā)光液曝光、拍照。ImageJ凝膠分析工具定量分析條帶灰度。

2.6 免疫熒光雙標(biāo)染色制備大腦皮層10μm冰凍切片，PBS洗片5 min×3次，微波抗原修復(fù)，10%羊血清37℃封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜：兔源KDM5A單克隆抗體（1∶500），兔源KDM5B單克隆抗體（1∶150），兔源KDM5C單克隆抗體（1：150），鼠源NeuN單克隆抗體（1∶200）。根據(jù)Ⅰ抗種屬分別滴加Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶200）或Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶200），37℃避光孵育1 h，Hoechst染核，37℃孵育25 min，封片觀察。

2.7高爾基染色孕鼠用5%的水合氯醛麻醉，完整剝離鼠腦，制備100μm大腦皮層冰凍切片，按照FD Rapid GolgiStain?Kit快速高爾基染色試劑盒說明書進(jìn)行高爾基染色，按照說明書進(jìn)行后續(xù)操作，封片。暗處晾干后觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件將測出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多樣本組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 B族維生素干預(yù)可減輕PM2.5導(dǎo)致的孕鼠抑郁樣行為

如圖2所示，與正常對照組相比，PM2.5暴露后的孕鼠總活動距離顯著減少（P＜0.01），進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)的時間（P＜0.05）與距離（P＜0.01）顯著減少；而與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預(yù)組孕鼠總活動距離顯著增加（P＜0.01），在中央?yún)^(qū)活動的距離和時間亦顯著增加（P＜0.05）。由此提示，B組維生素同步干預(yù)可以明顯減輕孕期PM2.5暴露導(dǎo)致的孕鼠抑郁樣行為。

2 B族維生素干預(yù)可緩解PM2.5導(dǎo)致的孕鼠大腦皮層神經(jīng)元損傷

NeuN免疫熒光染色顯示，與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層神經(jīng)元的細(xì)胞核出現(xiàn)形狀不規(guī)則或破裂，神經(jīng)元排布散亂、間隙較大，NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量減少，染色較淺；而經(jīng)過B族維生素干預(yù)后神經(jīng)元細(xì)胞核形狀規(guī)則，形態(tài)有所改善，神經(jīng)元排布較為整齊，NeuN陽性細(xì)胞分布和數(shù)量與對照組基本一致，提示B族維生素可以保護(hù)母體神經(jīng)細(xì)胞，見圖3A。

高爾基染色結(jié)果顯示，相較于對照組，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層椎體神經(jīng)元數(shù)量和樹突分支數(shù)量降低，神經(jīng)元樹突形態(tài)的復(fù)雜性下降，且星形神經(jīng)元向大腦皮層的外顆粒層分布；而經(jīng)過B族維生素干預(yù)后，大腦皮層椎體神經(jīng)元數(shù)量增多，樹突分支數(shù)得到一定恢復(fù)，樹突形態(tài)的復(fù)雜性也得到了一定保護(hù)，且星形神經(jīng)元分布恢復(fù)正常，見圖3B。這說明孕期給予B族維生素干預(yù)可以在一定程度上保護(hù)神經(jīng)元，避免PM2.5對孕鼠神經(jīng)元造成的損傷。

3 B族維生素干預(yù)可減輕PM2.5暴露導(dǎo)致的大腦皮層突觸損傷

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層軸突生長相關(guān)蛋白GAP-43蛋白表達(dá)水平下調(diào)，SYP和突觸后致密蛋白PSD95蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預(yù)組大腦皮層GAP-43表達(dá)水平上調(diào)，SYP和PSD95表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。這說明孕期給予B族維生素干預(yù)可以在一定程度上保護(hù)突觸可塑性，避免PM2.5對孕鼠的突觸可塑性造成損傷。

Figure 3.Immunofluorescent staining of NeuN（A）and Golgi staining（B）in cerebral cortex of pregnant mice in each group.The scale bar=50μm.圖3 各組孕鼠大腦皮層NeuN免疫熒光染色和高爾基染色

4 B族維生素干預(yù)可上調(diào)孕鼠大腦皮層KDM5家族的mRNA水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，孕鼠暴露于PM2.5后，大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；而與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預(yù)組孕鼠大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表達(dá)水平也顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。這說明孕期給予B族維生素干預(yù)可以在mRNA水平上調(diào)KDM5家族的表達(dá)。

5 B族維生素干預(yù)可提高孕鼠大腦皮層KDM5家族蛋白水平，降低H3K4me3表達(dá)

與對照組相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），H3K4me3表達(dá)水平則上升（P＜0.05），說明PM2.5可以引起孕鼠大腦皮層組蛋白甲基化水平升高；與PM2.5暴露組相比，B族維生素干預(yù)組大腦皮層KDM5A、KDM5B和KDM5C的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），而H3K4me3的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖6。這說明孕期給予B族維生素可以上調(diào)KDM5家族蛋白的表達(dá)，在一定程度上減輕PM2.5導(dǎo)致的甲基化水平異常。

6 B族維生素干預(yù)可上調(diào)孕鼠大腦皮層神經(jīng)元KDM5蛋白表達(dá)

免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，KDM5A、KDM5B和KDM5C熒光染色均主要表達(dá)在大腦皮層神經(jīng)元；相較于對照組，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大腦皮層KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+雙陽性神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少；而B族維生素同步干預(yù) 后，KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+雙陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，見圖7。這說明孕期B族維生素干預(yù)可通過上調(diào)神經(jīng)元中KDM5蛋白的表達(dá)，緩解PM2.5暴露對神經(jīng)元造成的損傷。

Figure 4.The protein expression of SYP，GAP-43 and PSD95 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.圖4 各組孕鼠大腦皮層中突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

Figure 5.Relative mRNA expression of KDM5 family in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.圖5 各組孕鼠大腦皮層中KDM5家族的mRNA表達(dá)情況

討 論

細(xì)顆粒物是一種能對全球公共健康造成巨大危害的城市空氣污染物。越來越多的證據(jù)表明，暴露于PM2.5會損傷腦等重要器官，造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重?fù)p害［1-3，5］。最新研究表明，PM2.5暴露與包括抑郁癥在內(nèi)的精神疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，生活在PM2.5暴露地區(qū)會出現(xiàn)焦慮，甚至自殺等嚴(yán)重后果［4］。孕婦在妊娠期孕育新生命的同時也經(jīng)歷著巨大的心理變化，易產(chǎn)生抑郁、焦慮等心理問題。對于孕期環(huán)境暴露的研究主要關(guān)注于子代的發(fā)育［12，16］，在空氣污染和妊娠的雙重壓力下觀察并探討孕婦的精神健康并尋找相應(yīng)的保護(hù)治療機(jī)制迫在眉睫。組蛋白H3K4甲基化狀態(tài)作為一種與神經(jīng)疾病密切相關(guān)的表觀遺傳修飾，其失衡不僅會影響機(jī)體的精神狀態(tài)，而且其去甲基化酶KDM5家族的表達(dá)也影響著機(jī)體的精神狀態(tài)［17］。KDM5家族由KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D組成，前3個成員與智力障礙、自閉癥譜系障礙和精神分裂癥等多種神經(jīng)疾病密切相關(guān)［18-19］。由此我們推測，PM2.5與妊娠雙重壓力下造成的孕鼠精神狀態(tài)的改變可能與KDM5家族有關(guān)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期大氣細(xì)顆粒物暴露會導(dǎo)致孕鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K4的甲基化修飾與神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關(guān)［17］。進(jìn)一步探究顆粒物暴露致孕鼠組蛋白修飾的變化，我們檢測發(fā)現(xiàn)PM2.5可導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)后大腦皮層組蛋白H3K4me3的表達(dá)水平升高，其相關(guān)的組蛋白去甲基化酶KDM5A、KDM5B和KDM5C表達(dá)均下調(diào)。說明妊娠期暴露于PM2.5會導(dǎo)致孕鼠組蛋白H3K4甲基化狀態(tài)增強(qiáng)，從而抑制基因表達(dá)。而研究發(fā)現(xiàn)患有神經(jīng)疾病，諸如ARID、ID/ASD和MRXSCJ的個體KDM5家族的表達(dá)降低［13］，與上述結(jié)果一致。研究報道，KDM5A和KDM5C作為關(guān)鍵調(diào)控基因在ASD發(fā)病中表達(dá)水平降低［18-19］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，孕期PM2.5會暴露會導(dǎo)致子代鼠出現(xiàn)自閉樣行為［20］。研究報道，某些表觀遺傳同樣存在跨帶遺傳現(xiàn)象［13］。因此，我們推測孕期暴露于PM2.5會導(dǎo)致孕鼠表觀遺傳發(fā)生改變，繼而通過表觀遺傳的跨代遺傳導(dǎo)致子鼠出現(xiàn)自閉癥。但這需要進(jìn)一步的研究證實。

Figure 6.Relative protein epression of KDM5 family and H3K4me3 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group.圖6 各組孕鼠大腦皮層KDM5家族及H3K4me3的蛋白表達(dá)情況

最新研究報道，機(jī)體可以通過補(bǔ)充維生素B來挽救因暴露于PM2.5環(huán)境而導(dǎo)致的DNA甲基化異常［20］，但是否可以預(yù)防PM2.5暴露所致的組蛋白甲基化異常，目前尚不明確。B族維生素具有抗炎、抗氧化的特性和免疫表觀遺傳效應(yīng)［21-22］，由此我們推測B族維生素可能對空氣污染引起的疾病也有一定的保護(hù)作用。本研究建立了妊娠期B族維生素干預(yù)PM2.5損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)孕鼠孕期給予一定的B族維生素干預(yù)后，大腦皮層中KDM5A、KDM5B和KDM5C的表達(dá)下降可以被挽救，H3K4的甲基化水平趨于正常。這說明B族維生素可以通過調(diào)節(jié)KDM5家族的表達(dá)一定程度上逆轉(zhuǎn)PM2.5所致的H3K4甲基化異常。近期研究表明，抑郁癥與突觸可塑性的改變關(guān)系密切［23］，我們推測PM2.5暴露調(diào)控組蛋白修飾變化導(dǎo)致的孕鼠抑郁樣行為可能與突觸可塑性有關(guān)，因此我們進(jìn)一步研究了突觸相關(guān)蛋白的改變。突觸相關(guān)蛋白SYP是一種存在于神經(jīng)末梢的突觸前囊泡蛋白，與突觸功能密切相關(guān)，是突觸前成分的標(biāo)志物，與突觸可塑性關(guān)系密切；軸突膜蛋白GAP-43是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，主要參與神經(jīng)細(xì)胞外生長及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細(xì)胞再生；PSD95是突觸后密度中豐富的支架蛋白是突觸后成分的標(biāo)志物，可促進(jìn)突觸形成，在突觸可塑性中起重要作用［24］。在B族維生素干預(yù)后，突觸相關(guān)蛋白GAP-43、SYP和PSD95的下降可以被挽救，神經(jīng)元的數(shù)量與形態(tài)也趨于正常，說明B族維生素可以在一定程度上保護(hù)母體的突觸可塑性，維持神經(jīng)元正常的功能形態(tài)。

Figure 7.Immunofluorescence double staining of KDM5（red）and NeuN（green）in the cerebral cortex of pregnant mice in each group.Blue：nuclei stained by Hoechst.The scale bar=50μm.圖7 各組孕鼠大腦皮層KDM5/NeuN免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果

綜上所述，孕期給予B族維生素同步干預(yù)可通過上調(diào)大腦皮層KDM5的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，糾正組蛋白甲基化異常，減輕PM2.5造成的神經(jīng)元損傷，從而緩解孕鼠抑郁樣行為。