時瀟麗， 楊德超， 徐光臨， 張建偉， 劉 力

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

淫羊藿、補骨脂為常用補益類中藥，前者具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕功效，而后者具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉、外用消風(fēng)祛斑功效，兩者均味辛性溫，兼能溫補腎陽，與其他補虛藥配伍使用常見于治療腎陽不足、肝腎虧損、肺腎氣虛或脾腎陽虛的處方中。近年來, 相繼有壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊等中成藥引起藥源性肝損傷的報道[1-2]，國家藥品監(jiān)督管理局也發(fā)布了相應(yīng)通報[3-4]，可能與方中淫羊藿、補骨脂肝毒性相關(guān)[1-2,5]，在免疫應(yīng)激狀態(tài)下兩者均可誘導(dǎo)本病，而且配伍較單用情況更嚴(yán)重[6]。因此，本研究對含淫羊藿、補骨脂中成藥進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并采用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)研究兩者配伍的潛在肝毒性成分及機制，以期為科學(xué)合理地使用相關(guān)中成藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 處方收集與分析 收集2020年版《中國藥典》和《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》中含有淫羊藿或補骨脂的中成藥處方，其中前者含淫羊藿的中成藥56種，含補骨脂的中成藥43種，同時含兩者的中成藥11種；后者含淫羊藿的中成藥180種，含補骨脂的中成藥129種，同時含兩者的中成藥47種。排除上述2部標(biāo)準(zhǔn)均收錄的6種(老年喘咳片、再造生血片、腎寶合劑、腎寶糖漿、蠶蛾公補片、益腎靈顆粒)，最終納入同時含淫羊藿、補骨脂的中成藥共52種。將上述中成藥錄入Excel 2019軟件，參照2020年版《中國藥典》和《中藥學(xué)》對中藥藥名、藥物功效分類、歸經(jīng)進(jìn)行規(guī)范后，對藥物、功效分類、歸經(jīng)、劑型、主治疾病頻次，以及淫羊藿、補骨脂日服用量進(jìn)行分析。

1.2 網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)研究

1.2.1 潛在肝毒性靶點篩選 通過PubMed、知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫檢索淫羊藿、補骨脂中與肝毒性相關(guān)的活性成分,利用SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測其相關(guān)靶點(probability≥0.05)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)中以“l(fā)iver toxicity”為關(guān)鍵詞，查找肝毒性相關(guān)靶點(score≥6.00)。采用Venny2.1在線工具將UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)規(guī)范化后的淫羊藿、補骨脂活性成分靶點與肝毒性主要靶點進(jìn)行交集分析，獲得兩者潛在肝毒性靶點。

1.2.2 肝毒性靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在肝毒性靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)中，構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI network)，生物種類設(shè)定為“Homosapiens”，其余參數(shù)保持默認(rèn)，結(jié)果保存為TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，對各靶點度值進(jìn)行排序，預(yù)測淫羊藿配伍補骨脂產(chǎn)生肝毒性的核心靶點。

1.2.3 藥物-活性成分-肝毒性靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將淫羊藿、補骨脂所含與肝毒性相關(guān)的活性成分和預(yù)測的潛在肝毒性靶點進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥物-成分-肝毒性靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，通過“Network Analyzer”功能進(jìn)行關(guān)鍵靶點的分析。

1.2.4 潛在肝毒性靶點功能與通路的富集分析 利用Omicshare平臺候選基因作為背景，對淫羊藿、補骨脂潛在肝毒性靶點進(jìn)行GO功能、KEGG信號通路富集分析，生物種類設(shè)定為“Homosapiens”，其中GO功能分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組成(celluar component，CC)。將GO功能、KEGG信號通路富集閾值設(shè)定為P<0.001，并對兩者進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次、功效、歸經(jīng) 在2020年版《中國藥典》中，木香分為木香、川木香，牛膝分為牛膝(懷牛膝)、川牛膝，附子分為附片、黑順片，同一品種不同炮制方法按同一藥材計，如“醋制五味子”“酒制五味子”“蒸五味子”均計為“五味子”，共得到227味中藥，累積頻數(shù)1 262次，排名前20的見表1，其中補骨脂包括生補骨脂21次、炒補骨脂5次、鹽補骨脂26次，淫羊藿包括生淫羊藿31次、炙淫羊藿21次。處方中頻次最多的中藥是補虛藥，其次是活血化瘀藥、溫里藥、收澀藥，見表2。處方中的中藥主要歸腎經(jīng)、肝經(jīng)，見表3。

表1 頻次前20的中藥

表2 中藥功效分布

表3 中藥歸經(jīng)分布

2.2 劑型與主治疾病 52種中成藥中有9種劑型，以丸劑最多，見表4，其中至寶三鞭丸為濃縮丸或大蜜丸，壯骨關(guān)節(jié)丸為濃縮丸或水丸，共計蜜丸8種、水丸4種、水蜜丸3種、濃縮丸3種，可發(fā)揮藥效持久、緩和毒性的特點，以治療腎陽不足、氣血虛弱等證型為主。另外，主治疾病包括腎系疾病、肺系疾病、肝腎疾病、脾腎疾病、關(guān)節(jié)炎等，見表5，其中有47種涉及補腎功效。

表4 中成藥劑型分布

表5 中成藥主治疾病分布

2.3 淫羊藿、補骨脂日服用量分析 29種中成藥因處方未公布藥味劑量或未詳細(xì)闡述制備方法，未能計算出中成藥中淫羊藿、補骨脂的日服用劑量，其余見表6(按2020年版《中國藥典》用法用量中的最大服用量計算)，可知絕大多數(shù)均在6～10 g范圍內(nèi)，僅生白合劑(生白口服液)中淫羊藿、補骨脂，以及肺氣腫片中補骨脂存在超量風(fēng)險。

表6 淫羊藿、補骨脂日服用量

2.4 網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)研究

2.4.1 潛在肝毒性靶點篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[7-17]報道，篩選出淫羊藿中與肝毒性相關(guān)的活性成分有淫羊藿素、寶藿苷Ⅰ等8種，通過SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶點有122個；補骨脂中相關(guān)成分有補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚等7種，預(yù)測的靶點有264個，見表7，其中兩者共有靶點有60個。再通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲得與肝毒性相關(guān)的靶點共1 122個，將活性成分靶點與其取交集，共得到109個交集靶點，即為潛在肝毒性靶點。

表7 淫羊藿、補骨脂中與肝毒性相關(guān)的活性成分

2.4.2 潛在肝毒性靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用String數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.6.0構(gòu)建“2.4.1”項下潛在肝毒性靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，可知108個靶點之間可發(fā)生蛋白相互作用(1個靶點未參與)，其中度值≥30的靶點共16個，分別為AKT1、CASP3、EGFR、MAPK3、HSP90AA1、ESR1、MAPK1、TNF、ERBB2、PTGS2、BCL2L1、EP300、PIK3CA、PPARG、APP、MCL1，可能是核心靶點。

注：連線代表蛋白與蛋白之間的相互作用。節(jié)點越大，顏色越深，表示度值越大。

2.4.3 藥物-活性成分-肝毒性靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建淫羊藿、補骨脂，與肝毒性相關(guān)的活性成分，“2.4.1”項下潛在肝毒性靶點的網(wǎng)絡(luò)，見圖2。在與肝毒性相關(guān)的活性成分中，度值排名靠前的為淫羊藿中淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ，以及補骨脂中補骨脂二氫黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂乙素、補骨脂酚，推測淫羊藿與補骨脂配伍后可能通過EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶點加重肝損傷，見表8。

2.4.4 富集分析 排名前20的GO、KEGG富集分析結(jié)果見圖3，可知生物過程相關(guān)的條目有359條，主要涉及刺激反應(yīng)、絲氨酸肽磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death)等；分子功能相關(guān)的條目有53條，主要涉及催化活性(catalytic activity)、相同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、小分子結(jié)合(small molecule binding)等；細(xì)胞組成相關(guān)的條目有32條，主要涉及細(xì)胞質(zhì)部分(cytoplasmic part)、胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)腔(intracellular organelle lumen)等，而KEGG 通路富集有116個，主要涉及癌癥途徑(pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、癌癥中的中央碳代謝(central carbon metabolismin cancer)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等。

注：藍(lán)色節(jié)點代表淫羊藿、補骨脂，綠色節(jié)點代表與肝毒性相關(guān)的活性成分，紅色、黃色節(jié)點代表肝毒性靶點(其中黃色節(jié)點為兩藥共有肝毒性靶點)，每條邊代表節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。

3 討論

在2020年版《中國藥典》中，同時含淫羊藿、補骨脂的中成藥數(shù)量占相關(guān)中成藥總數(shù)的12.5%，而在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》中其占比為17.9%。在52種中成藥中，除了正骨膏為清代宮廷御醫(yī)所創(chuàng)驗方外，其余均為院內(nèi)制劑或民間驗方研發(fā)制得。在國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心分別于2001、2008年對壯骨關(guān)節(jié)丸引起肝損傷等不良反應(yīng)情況進(jìn)行通報[2]后，國內(nèi)研究者針對壯骨關(guān)節(jié)丸的毒性藥材、肝毒性機制和合理用藥等進(jìn)行了探索，從動物或細(xì)胞實驗已證實補骨脂、淫羊藿單味藥材或其中所含活性成分具有一定的肝損傷作用[7-17]。因此，存在超劑量風(fēng)險的如生白合劑、肺氣腫片以及長時間用藥的中成藥如補腎防喘片(在用法用量中注明3個月為1個療程)等安全性需重點關(guān)注。

生白合劑(口服液)主要用于癌癥放化療引起的白細(xì)胞減少屬脾腎陽虛等，制劑中淫羊藿、補骨脂的日服用劑量均大于2020年版《中國藥典》用法用量，在對2 140例患者服用生白口服液的安全性研究中，共報道5例有谷丙轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，未見明顯肝腎功損害或其他不良反應(yīng)[18]，表明該制劑短周期服用(7～14 d)相對安全。但壯骨關(guān)節(jié)丸中淫羊藿、補骨脂日服用劑量遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定，且制劑中乳香、沒藥等易致肝損傷中藥的日服用量也相對較低，在肝毒性病例報道中部分患者口服該制劑經(jīng)常連續(xù)數(shù)月，推測發(fā)生肝臟不良反應(yīng)的原因可能是長期連續(xù)服用導(dǎo)致藥物蓄積，提示上述中藥的日服用劑量雖然沒有超劑量，但也應(yīng)警惕長期用藥安全性[2]。

合理配伍是降低中藥毒性的有效措施，從而提高臨床用藥的安全性。黃迎等[1]基于免疫應(yīng)激介導(dǎo)的特異質(zhì)肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆方中續(xù)斷、知母、地黃、丹參有減輕淫羊藿、補骨脂引起的肝損傷作用，以丹參效果最好。凌潔等[19]提出斑馬魚毒性/代謝同步進(jìn)程法，揭示了淫羊藿中毒及其配伍巴戟天后的減毒作用。劉巧等[20]報道，補骨脂配伍生地、制首烏等可降低補骨脂產(chǎn)生的肝損傷。寧青等[21]發(fā)現(xiàn)，杜仲中桃葉珊瑚苷可顯著降低補骨脂對斑馬魚的肝臟毒性影響。在52種中成藥中，續(xù)斷出現(xiàn)11次，知母出現(xiàn)5次，地黃出現(xiàn)48次(含生地黃13次)，丹參出現(xiàn)5次，巴戟天出現(xiàn)17次，杜仲出現(xiàn)19次，但目前有關(guān)淫羊藿或補骨脂的配伍減毒及其機制的報道仍較少，因此，如何能在保證兩者發(fā)揮最佳療效的同時，通過藥味配伍使其毒性降到最低尚有待進(jìn)一步研究。

在藥物-活性成分-肝毒性靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿、補骨脂肝毒性關(guān)鍵成分通過核心靶點產(chǎn)生作用，與肝細(xì)胞內(nèi)部分蛋白氧化磷酸化、相互結(jié)合等生物學(xué)過程及AGE-RAGE、HIF-1信號通路等相關(guān)，兩者配伍后，可能通過EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶點加重肝損傷。Gao等[22]參考壯骨關(guān)節(jié)丸中淫羊藿、補骨脂的劑量，通過非肝毒性劑量的脂多糖大鼠模型對淫羊藿、補骨脂、兩者配伍致肝損傷問題進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)激下，“淫羊藿與補骨脂”為一對新的中藥配伍禁忌組合，NLRP3(NLR family, pyrin domaincontaining 3)炎癥小體活化相關(guān)病證是其致肝損傷的主要易感人群特征[22-23]。由此可知，中藥配伍禁忌是有條件和相對的，淫羊藿、補骨脂配伍合理性有待繼續(xù)確證。

眾所周知，“是藥三分毒”，故應(yīng)客觀科學(xué)認(rèn)識淫羊藿、補骨脂的肝損傷問題。目前，有關(guān)補骨脂、淫羊藿單味藥材或其活性成分肝毒性的研究基本上為動物、細(xì)胞實驗等，但所得結(jié)果往往與臨床實際有一定差距。因此，醫(yī)藥工作者在臨床上應(yīng)關(guān)注含淫羊藿、補骨脂中成藥的安全性，尤其是對長期用藥患者，應(yīng)監(jiān)測其肝功能。