楊 倩, 雷一騰, 馬貝貝, 朱 濤, 蔣中英, , 3

(1. 伊犁師范大學(xué) 電子與信息工程學(xué)院 微納電傳感技術(shù)與仿生器械重點實驗室, 伊寧 835000；2. 南京大學(xué)物理學(xué)院 固體微結(jié)構(gòu)物理國家重點實驗室, 南京 210093；3.伊犁師范大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆凝聚態(tài)相變與微結(jié)構(gòu)實驗室, 伊寧 835000)

1 引 言

納米顆粒因腫瘤靶向性、多樣的物化性質(zhì), 具有廣闊的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景. 其醫(yī)學(xué)功能性質(zhì)與顆粒在生物膜表面的吸附行為緊密相關(guān)[1]. 吸附動力學(xué)與平衡態(tài)決定著顆粒的生物相容性、內(nèi)吞途徑及代謝方式[2].

許多國內(nèi)外課題組開展了納米顆粒在生物膜表面吸附的研究. 如中科院姜秀娥、南京大學(xué)馬余強(qiáng)等報道了雙親性化學(xué)修飾、蛋白冠等對顆粒吸附及內(nèi)吞的影響[2-4]. 為了獲得高敏感的實時表征, 研究者往往采用界面表征手段, 以處于溶液底層的支撐膜、囊泡來探索顆粒吸附的可控性. 但是, 該模型假設(shè)顆粒在溶液中是均勻分布的, 這可能存在缺陷. 夏幼南等發(fā)現(xiàn)底層的顆粒濃度顯著高于頂層, 差異值與顆粒尺寸、空心實心相關(guān), 重力在濃度不均性中發(fā)揮了支配作用[5]. 我們早前的研究也發(fā)現(xiàn)了團(tuán)聚及沉淀對底層顆粒富集的影響[6]. 濃度的改變可造成顆粒在生物膜表面吸附動力學(xué)與平衡態(tài)的變化[7]. 但是, 作為常見納米顆粒的調(diào)節(jié)參量, 顆粒形狀是否會影響重力產(chǎn)生的濃度不均性, 進(jìn)而影響顆粒在膜表面的吸附仍是不清楚的.

在本研究中, 采用石英電子微天平及耗散系數(shù)測量儀 (QCM-D) , 以正置 (Upright) 與倒置 (Inverted) 實驗考察了在不同溶液高度, 生物膜對三種金納米棒的吸附行為. 發(fā)現(xiàn)重力使金棒產(chǎn)生溶液分布的不均性; 長寬比影響了金棒的流體力學(xué)尺寸和濃度不均程度, 是調(diào)節(jié)金棒吸附量的重要因素. 研究深化了納米顆粒與生物膜作用機(jī)制的理解.

2 實驗部分

2.1 實驗材料

二油?；字Ｄ憠A (DOPC) 購于Avanti Polar Lipids. 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris) 購于Sigma. 氯金酸 (HAuCl4) 、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 、硼氫化鈉 (NaBH4) 、硝酸銀 (AgNO3) 、抗敗血酸 (AA) 等購于國藥集團(tuán). 實驗用水通過Milli-Q超純水系統(tǒng)凈化 (電阻>18.2 MΩ.cm) .

2.2 金納米棒的制備

通過種子法制備了三種金棒[8]. 在22.5 mL CTAB (0.1 M) 溶液中加入0.75 mL HAuCl4(0.01 M) 與1.8 mL NaBH4(0.01 M) . 快速攪拌反應(yīng)2小時, 生成種子. 將50 mL CTAB (0.1 M) , 2.448 mL HAuCl4 (0.01 M) , 1 mL H2SO4(0.5 M) 與不同體積的AgNO3(0.01 M) 混合獲得生長溶液. 加入0.4 mL AA (0.1 M) 與0.12 mL種子攪拌均勻, 靜置過夜生成金納米棒. 金棒采用離心清洗3次. 形貌通過透射電鏡 (JEOL JEM-2100) 表征, 吸收光譜通過單光束紫外可見光光度計 (菁華759S) 表征, 金濃度通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 (PE Avio500) 表征. 在實驗前將金棒超聲稀釋至Tris-HCl緩沖液 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7) , 獲得0.01 mg/mL的樣品溶液.

2.3 支撐膜的制備

通過小囊泡在襯底的自發(fā)融合制備支撐膜[9]. 首先, 在燒杯中加入DOPC氯仿溶液, 氮氣吹干并真空干燥6小時, 形成磷脂干膜. 隨后, 在燒杯中加入Tris-HCl緩沖液, 室溫水化3小時, 形成多層囊泡懸濁液. 再使用擠出器 (100 nm孔徑濾膜) 反復(fù)擠壓樣品生成單層小囊泡. 最后, 將QCM-D的二氧化硅襯底芯片浸于囊泡溶液中, 自發(fā)融合形成DOPC支撐膜.

2.4 QCM-D的正、倒置實驗

QCM-D (E1 Qsense) 通過共振頻率峰偏移量 (Δf) 與耗散系數(shù) (ΔD) 表征吸附層的質(zhì)量 (Δm) 與粘滯性. 基于Sauerbery關(guān)系[6], Δm與Δf成正比:

Δm=-C·Δf/n

(1)

其中C為質(zhì)量敏感常數(shù),n為協(xié)頻數(shù). 吸附層的粘滯性越高, ΔD越大. 在正置實驗中, 將QCM-D艙室正立放置, 芯片與支撐膜處于溶液底層. 在倒置實驗中, 將艙室倒立放置, 芯片與支撐膜處于溶液頂層. 具體實驗步驟如下: 泵入緩沖液, 待QCM-D基線穩(wěn)定后, 加入囊泡自發(fā)融合形成磷脂支撐膜. 緩沖液沖洗后, 緩慢泵入金納米棒溶液3 min. 隨后關(guān)閉蠕動泵, 產(chǎn)生靜置的溶液環(huán)境.

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米棒與支撐膜的表征

通過種子法制備了三種金棒. 采用透射電鏡表征了金棒的尺寸與形貌. 如圖1abc與表1所示, 在生長溶液中添加0.15、0.375、0.75 mL AgNO3分別產(chǎn)生了長寬比 (L/R) 為1.6、2.8、7.1的棒狀結(jié)構(gòu) (簡稱短棒ShortNR、中棒MiddleNR、長棒LongNR) . 圖1d給出了它們的吸收光譜. 兩消光峰由短軸、長軸的等離子體共振產(chǎn)生[10]. 隨著L/R的逐漸增大, 兩消光峰的間距由85、228擴(kuò)大至363 nm. 并且, 由于生長溶液中過量的AA完全還原了AuCl4-[8], 單個種子成長獲取的金原子數(shù)相近, 產(chǎn)生的三種金棒質(zhì)量(mAu)相似 (表1) .

表1 金納米棒的物理性質(zhì)

采用QCM-D表征了DOPC囊泡在二氧化硅襯底的組裝動力學(xué). 如圖1e所示, 正、倒置實驗獲取的實驗曲線相似. 最初Δf降低ΔD提高, 表明高耗散的囊泡吸附; 隨后Δf升高ΔD降低, 說明囊泡破裂釋放水, 形成低耗散的支撐片層膜; 最終Δf與ΔD穩(wěn)定在約-25 Hz、0.5 × 10-6, 表明形成了完整的支撐膜[11].

圖1 金納米棒與支撐膜的表征. (a) 短棒、(b) 中棒、(c) 長棒的透射電鏡圖. 標(biāo)尺為100 nm. (d) 金棒的紫外可見吸收光譜. (e) QCM-D表征囊泡自發(fā)融合形成支撐膜.

3.2 金納米棒吸附的表征

使用QCM-D表征了金棒在支撐膜表面的吸附. 在正、倒置實驗中, 金棒溶液的浸泡均造成了Δf的顯著降低與ΔD的略微提高 (圖2ab) , 說明強(qiáng)剛性的金棒吸附至支撐膜表面. 基于Sauerbery關(guān)系統(tǒng)計了1 h吸附的金棒質(zhì)量 (圖2c) . 在正置實驗中, ΔmlongNR<ΔmmiddleNR<ΔmshortNR, 即L/R較小的金棒吸附量較高. 這與Crespy、Paul等基于顆粒內(nèi)吞的研究結(jié)果是一致的, 他們將此歸因于長棒的高曲率不利于生物膜的吸附與包裹[12, 13]. 但在倒置實驗中, ΔmmiddleNR<ΔmlongNR<ΔmshortNR, 即L/R適中金棒產(chǎn)生了最高的吸附量. 因此, 正、倒置實驗獲得了不一致的金棒長寬比與吸附量排序關(guān)系. 定義了正、倒置實驗給定金棒的吸附差異d以進(jìn)一步對圖2bc分析：

(2)

其中Δmu、Δmi分別表示正、倒置實驗測得吸附金質(zhì)量. 如圖2d所示, 首先d恒為正值, 表明每種金棒的正置實驗吸附量始終大于倒置實驗吸附量. 其次,d均隨時間成長, 說明正、倒置實驗的吸附差異是逐漸產(chǎn)生的. 更為重要的是, 在任一時刻dlongNR

圖2 金納米棒在支撐膜表面的吸附. (a) 正置實驗; (b) 倒置實驗; (c) 培養(yǎng)1 h的金棒吸附質(zhì)量; (d) 正、倒置實驗的吸附差異d.

3.3 正倒置實驗差異的分析

對正、倒置實驗中金棒吸附的差異根源進(jìn)行分析, 并討論金棒長寬比對此差異的影響來理解上述結(jié)果. 由于正、倒置實驗中, 金棒與磷脂膜的范德華和靜電等作用不變, 但重力驅(qū)動金棒運動的方向反轉(zhuǎn). 因此, 吸附差異應(yīng)源于重力產(chǎn)生的金棒濃度不均性 (圖3a) . 相較于理想的均勻分布的樣品, 重力使底層的金棒濃度提高, 增大了正置實驗的吸附量; 但也降低了頂層的金棒濃度, 減小了倒置實驗的吸附量. 因此, 實驗獲得的d總是大于零 (圖2d).

從自由能角度, 金棒向底部沉淀是重力勢能最小化的結(jié)果, 但它的局域富集不利于體系熵的最大化. 兩者的競爭造成了金棒的平衡不均分布[14]. 由于金棒的實驗濃度較低 (體積占比約5 × 10-7) , 可用氣體模型描述它在溶液高度z的平衡濃度c(z)[15]:

c(z)=c0exp(-zmbg/kBT)

(3)

其中c0為歸一化的濃度常量, g為重力加速度, kB為玻爾茲曼常數(shù),T為絕對溫度,mb為浮力質(zhì)量[6]:

mb=(ρAu-ρBuffer)mAu/ρAu)

(4)

其中ρAu、ρBuffer分別為金與緩沖液的密度. 將表1數(shù)據(jù)代入式3、4可得, 短棒、中棒、長棒在給定溶液高度的平衡濃度是基本相同的, 頂層比底層的平衡濃度高一個量級 (圖3b) . 但是, 平衡不均分布是重力引起金棒再分布的極端情形, 需要消耗時間以達(dá)到該平衡[14, 15]. 基于stokes關(guān)系, 再分布消耗時間 (teq) 可由下式計算[15]:

(5)

其中η是緩沖液粘滯性,D為流體力學(xué)直徑. 對于棒狀粒子[16]:

(6)

圖3c給出了三種金棒的D與teq.teq都達(dá)到小時量級, 表明金棒的不均再分布過程較為緩慢, 因此在實驗中觀測到了長時間增長的d(圖2d) . 同時,teq隨著金棒L/R值的增大而提高 (圖3c) , 說明金棒長寬比可通過影響的流體力學(xué)尺寸D, 調(diào)節(jié)再分布消耗時間. 長棒具有較高的流體力學(xué)尺寸, 再分布消耗時間長, 保持了較均一溶液濃度, 因此正、倒置實驗吸附差異低. 而短棒具有較小的流體力學(xué)尺寸, 再分布消耗時間短, 迅速地形成了不均勻的溶液分布, 因此正、倒置實驗吸附差異大 (圖2d) . 最后, 由于短棒、中棒、長棒濃度不均程度的差異, 導(dǎo)致了它們在不同溶液高度吸附量排序的變化, 即正、倒置實驗中觀測到的不一致的金棒長寬比與吸附量排序關(guān)系 (圖2c) .

圖3 (a) 正、倒置實驗中支撐膜表面金棒吸附差異的示意圖. L/R小的金棒, 更迅速實現(xiàn)非均分布, 頂、底層支撐膜吸附差異大; L/R高的金棒, 溶液濃度保持較均一, 頂、底層支撐膜吸附差異小. (b) 在QCM-D艙室中 (高度約1 mm) , 三種金棒的平衡濃度c(z) . (c) 三種金棒的流體力學(xué)直徑D與再分布消耗時間teq.

4 結(jié) 論

在本研究中, 探索了納米顆粒在重力場下支撐膜表面吸附中的形狀效應(yīng). 發(fā)現(xiàn), 金棒的長寬比影響了重力產(chǎn)生的濃度不均性. 對于L/R值大的金棒, 再分布消耗時間長, 能夠長時間維持溶液濃度的均一, 有助于保持不同溶液高度吸附量的一致. 由于不同L/R產(chǎn)生了濃度不均程度的差異, 在溶液底層短棒的吸附量最大, 在溶液頂層中棒的吸附量最大. 研究為金納米棒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了參考.