季 敏，蘇麗萍，劉 麗，管雅玲，肖錦玲，蒲紅偉

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，烏魯木齊 830017；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2病理科，3學(xué)科建設(shè)科，烏魯木齊 830054)

海洛因?qū)W名二乙酰嗎啡，可損害人體健康，影響社會，嚴重威脅著各國公共衛(wèi)生安全。海洛因具有很強的生物毒性和成癮性[1]。人體對海洛因依賴會導(dǎo)致其心血管系統(tǒng)的受損，最常見的臨床表現(xiàn)為心律失常[2]。有研究表明，海洛因成癮者心電圖參數(shù)異常的發(fā)生率顯著高于健康人群，其心律失常的發(fā)生率可達35.16%[3]。Ca2+作為心肌細胞內(nèi)主要的第二信使對維持心肌細胞正常電生理功能具有重要作用。Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseII，CaMKII)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，受Ca2+/CaM復(fù)合物的調(diào)節(jié)[4]，分為α、β、γ和δ四種亞型[5]，在心肌細胞中主要為δ亞型[6]。CaMKII被認為是興奮-收縮耦合過程的重要因子，可影響心肌細胞內(nèi)Ca2+含量的變化，適度激活有益于心臟正常功能運行，但持續(xù)激活可能會導(dǎo)致心臟功能障礙[7]。原肌球蛋白1(Tropomyosin1，TPM1)是原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)家族中的一員，是心肌收縮蛋白之一，其與肌鈣蛋白根據(jù)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度共同調(diào)節(jié)心肌的收縮，然而心肌收縮蛋白的異常可影響心肌Ca2+的敏感性，甚至使心肌收縮功能發(fā)生異常[8-11]。本研究從海洛因及選擇性CaMKII抑制劑KN-93[12]對心肌細胞內(nèi)Ca2+變化及相關(guān)因子表達水平入手，探討CaMKII、TPM1與海洛因?qū)е滦募〖毎?jié)律頻率異常間的關(guān)系，為臨床中因海洛因?qū)е碌男穆墒С；颊咛峁┬碌脑\療方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器選取SPF級SD大鼠乳鼠60只，3日齡，雌雄不限。實驗動物購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2018-0002；動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003]，實驗已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(IACUC201805-K1)。海洛因(由新疆維吾爾自治區(qū)緝毒總隊提供)；α-肌動蛋白(α-actin)抗體(ab37346)、β-tubulin抗體(ab6046)、p-CaMKIIδ(phospho T287)抗體(ab182647)均購自英國Abcam公司；Tropomyosin1/3抗體(美國Cell Signaling公司，3913S)；CaMKIIδ抗體(美國Santa Cruz公司，SC-100362)；胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司；膜再生液、Fluo-4 AM鈣熒光探針、D-Hanks液、4%多聚甲醛溶液購自北京Solarbio公司；5-溴-2’-脫氧尿苷(5-Brdu)(美國Sigma 公司)；低溫高速離心機(美國Hitiachi公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；37℃恒溫培養(yǎng)箱(美國Themo science公司)。

1.2 原代心肌細胞分離和培養(yǎng)所有實驗動物麻醉后在無菌條件下75%乙醇消毒，沿左鎖骨中線剪開皮膚，取其心臟置于D-Hanks液中。眼科剪去除心房，將心尖分成7～8瓣，放入胰酶中，4℃搖床過夜，消化，棄上清；加入Ⅱ型膠原酶，37℃水浴震蕩10 min，1000 r/min離心5 min，棄上清；加入含有5-Brdu的完全培養(yǎng)基，緩慢吹打混勻，移入細胞培養(yǎng)皿。差速貼壁后，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱備用。

1.3 免疫熒光法鑒定心肌細胞將培養(yǎng)好的原代心肌細胞鋪至激光共聚焦皿中，置于培養(yǎng)箱48 h，PBS洗滌3次；4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS洗滌3次；室溫封閉50 min，α-actin(1∶500)覆蓋組織，4℃過夜。第二天復(fù)溫后PBS洗滌3次，熒光二抗覆蓋，室溫避光2 h，細胞核染料染色8 min，PBS洗滌3次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況[13]。

1.4 實驗分組與處理將培養(yǎng)好的原代心肌細胞分為對照組(Control組)常規(guī)條件未作任何處理；海洛因處理組(HE組)加入100 μmol/L 海洛因作用24 h[14]；海洛因+KN-93組(HE+KN-93組)加入100 μmol/L海洛因+1μmol/L KN-93作用24 h。

1.5 各組心肌細胞自發(fā)搏動頻率測定將密度為1×105個/mL原代心肌細胞接種于多聚賴氨酸預(yù)處理過的6孔板中，每孔液體量為2 mL，培養(yǎng)5～7 d。各組按照相應(yīng)計量進行藥物干預(yù)，每孔隨機選取4個視野，同時由2名具有高級實驗師資質(zhì)的技術(shù)人員置于顯微鏡下觀察，紀錄1 min內(nèi)細胞搏動次數(shù)，共重復(fù)4次。

1.6 Fluo-4 AM熒光探針檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度取各組細胞，PBS洗滌后加入終濃度為5 μmol/L的Fluo-4 AM熒光探針，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次，加入1 mL PBS，37℃孵育30 min。使用流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度，激發(fā)波長494 nm，發(fā)射波長516 nm，每組細胞計數(shù)共3 000個，采用刺激后平均熒光強度(mean-FITC-A)檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度[15]。

1.7 串聯(lián)質(zhì)譜標記相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異表達蛋白實驗由上海中科新生命生物科技有限公司完成：取各組細胞，經(jīng)蛋白質(zhì)提取、定量、TMT標記、肽段分級后，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)采集數(shù)據(jù)，以差異倍數(shù)≥1.2倍，P<0.05為標準，篩選出差異表達蛋白質(zhì)，使用層次聚類算法對差異表達蛋白質(zhì)進行聚類分析。

1.8 Western blotting法檢測CaMKIIδ、p-CaMKII(T287)、TPM1蛋白表達水平收集各組細胞沉淀，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。蛋白上樣量為40 μg，電泳后使用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h，分別加入CaMKIIδ抗體(1∶200)、p-CaMKIIδ phospho T287抗體(1∶500)、Tropomyosin1/3抗體(1∶2 000)、β-tubulin抗體(1∶1 500)，4℃搖床過夜。分別加入山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)、山羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫搖床放置120 min，TBST洗膜，進行條帶曝光。使用Image Lab軟件測量各條帶灰度值，目標蛋白與內(nèi)參β-tubulin灰度值進行比較，獲得目標蛋白相對表達量，并進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞的鑒定激光共聚焦顯微鏡下可見原代心肌細胞多為梭形或多邊形，少數(shù)為圓形。其折光性強，有自發(fā)性搏動。在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，細胞胞漿被α-actin特異性染色成綠色(圖1-A)，DAPI將細胞核染成藍色(圖1-B)，證實為心肌細胞(圖1-C)；細胞胞漿未染色，細胞核染成藍色，為非心肌細胞。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，心肌細胞純度達95%以上，可用于后續(xù)實驗。

ABC注:A,α-actin特異性染為綠色;B,細胞核被DAPI染為藍色;C,A與B合成C。

2.2 各組心肌細胞自發(fā)搏動頻率的比較Control組心肌細胞平均自發(fā)搏動頻率(126.33±1.52)次/min高于HE組(88.00±2.64)次/min，HE+KN-93組心肌細胞平均自發(fā)搏動頻率(110.33±1.52)次/min高于HE組(88.00±2.64)次/min，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的比較與Control組比較，HE組心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HE組比較，HE+KN-93組細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

ABCD 注:A,Control組流式圖;B,HE組流式圖;C,HE+KN-93組流式圖;D,各組平均熒光強度統(tǒng)計圖。與Control組比較,?P<0.05;與HE組比較,#P<0.05。

2.4 各組心肌細胞內(nèi)的差異表達蛋白結(jié)果串聯(lián)質(zhì)譜標記相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定出5 884個差異表達蛋白；HE組與Control組共篩選出差異表達蛋白784個，其中上調(diào)差異表達蛋白質(zhì)有442個，下調(diào)差異表達蛋白質(zhì)有342個。HE組與HE+KN-93組共篩選出346個差異表達蛋白，其中上調(diào)差異表達蛋白質(zhì)有169個，下調(diào)差異表達蛋白質(zhì)有177個，前10個差異表達蛋白見表1、表2。與 Control組比較，HE組TPM1蛋白相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；與HE+KN-93組比較，HE組TPM1蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.043)；3組CaMKIIδ蛋白質(zhì)相對表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.732)(表3)。

表1 各組心肌細胞前10個上調(diào)差異表達蛋白

表2 各組心肌細胞前10個下調(diào)差異表達蛋白

表3 各組中CaMKIIδ與TPM1蛋白相對表達量

2.5 各組心肌細胞內(nèi)CaMKIIδ、p-CaMKII(T287)和TPM1蛋白的表達與Control組比較，HE組p-CaMKII(T287)、TPM1蛋白相對表達量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HE組比較，HE+KN-93組p-CaMKII(T287)、TPM1蛋白相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組CaMKIIδ蛋白相對表達量均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

AB 注:A,各組CaMKIIδ、p-CaMKII(T287)、TPM1的蛋白電泳圖;B,各組CaMKIIδ、p-CaMKII(T287)、TPM1的蛋白相對表達量;與Control組比較,?P<0.05;與HE組比較,#P<0.05。

3 討論

近年來海洛因濫用對心血管損傷的作用機制已成為研究熱點，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)海洛因成癮和濫用可使大鼠心電圖出現(xiàn)不同程度的變化，可引起心肌細胞自發(fā)搏動頻率的改變[16]，但其具體機制有待進一步研究。心肌屬于橫紋肌，而肌動蛋白是心肌細胞重要的骨架蛋白，因此本研究選用α-肌動蛋白(Sarcomeric-α-actin)抗體進行免疫熒光染色鑒定心肌細胞，結(jié)果顯示心肌細胞純度達95%以上，可用于后續(xù)實驗。通過檢測海洛因及CaMKII抑制劑KN-93對心肌細胞內(nèi)Ca2+變化及相關(guān)蛋白表達水平，分析探討CaMKII、TPM1與海洛因?qū)е滦募〖毎l率異常的相關(guān)性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HE組心肌細胞自發(fā)搏動頻率下降，心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，這提示海洛因在一定程度上可造成心肌細胞內(nèi)Ca2+異常改變，進而誘發(fā)心肌細胞節(jié)律異常改變。Ca2+是心肌細胞內(nèi)重要的第二信使，可調(diào)節(jié)多種信號傳導(dǎo)通路。CaMKII對正常的Ca2+穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7]。有研究結(jié)果顯示，與正常對照組大鼠心肌組織相比，代謝綜合征模型大鼠心肌細胞CaMKII T287位點表達水平顯著上調(diào)，導(dǎo)致舒張期肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+異常泄露，增加心律失常發(fā)生頻率[17]。本研究中，HE組心肌細胞中CaMKII(T287)表達水平與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度均顯著高于Control組。通過串聯(lián)質(zhì)譜標記相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對3組細胞研究發(fā)現(xiàn)，海洛因可影響心肌細胞Cardiac muscle contraction信號通路(rno04260)中TPM1、慢肌肌鈣蛋白 C(TNNC1)、心肌肌鈣蛋白I(TNNI3)、心肌肌鈣蛋白T(TNNT2)、組氨酸豐富鈣結(jié)合蛋白(HRC)等蛋白質(zhì)的改變，而并不影響心肌細胞內(nèi)CaMKII蛋白表達，但通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，海洛因可影響CaMKII(T287)表達水平，這與Zhao[12]等研究結(jié)果一致。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，海洛因可上調(diào)心肌細胞內(nèi)CaMKII(T287)表達水平及TPM1蛋白表達水平，而使用CaMKII特異性抑制劑KN-93抑制CaMKII(T287)磷酸化后，TPM1蛋白相對表達量降低。研究者發(fā)現(xiàn)，TPM突變可引起心律失常，其機制可能與肌絲對Ca2+濃度的敏感性發(fā)生改變有關(guān)，正常生理條件下TPM可將信號從肌動蛋白單體傳遞至肌動蛋白絲內(nèi)其他肌動蛋白單體，通過結(jié)合肌動蛋白表面不同位點，精確調(diào)節(jié)激活的肌動蛋白單體數(shù)量，引起肌肉收縮[18]。CaMKII與TPM1的作用可能由胞質(zhì)內(nèi)Ca2+介導(dǎo)而產(chǎn)生。

綜上所述，海洛因可在一定程度上引起心肌細胞節(jié)律及Ca2+濃度的異常，可能是通過激活CaMKII蛋白，調(diào)節(jié)下游因子TPM1的表達，誘發(fā)心律失常，可為研究CaMKII參與海洛因致心律失常的作用機制和因海洛因致心律失?；颊咛綄ば碌乃幬锇悬c提供理論依據(jù)。